新城疫病毒融合蛋白胞內(nèi)尾部關(guān)鍵氨基酸定位

摘要：新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病,具有很高的發(fā)病率和病死率,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害極大。為了探討新城疫病毒融合蛋白(Fusion protein,F)胞內(nèi)尾部(Cytoplasmic tail,CT)后段的氨基酸(Amino acid,aa)在細(xì)胞融合中的作用,定位該區(qū)域影響F蛋白功能的關(guān)鍵氨基酸,本研究利用基因定點(diǎn)突變和體內(nèi)同源重組技術(shù)構(gòu)建7個(gè)突變體,經(jīng)BHK-21細(xì)胞表達(dá)后,分別用間接免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)定性和定量檢測(cè)各突變體蛋白的表達(dá)效率,采用R18染料轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)、指示基因法、吉姆薩染色對(duì)各突變體蛋白促細(xì)胞融合的三個(gè)階段分別進(jìn)行分析,并利用Western Blot檢測(cè)突變體功能的改變是否與F蛋白的裂解活化有關(guān)。結(jié)果顯示,與野生型F蛋白相比,突變體N542A、L544A、M547A的半融合活性均發(fā)生了顯著變化,分別為野生型的189.8%、58.5%和17.3%,而突變體G540A、N541A、G545A、Q546A的半融合活性處于野生型的80.1%~117.5%之間(P均大于0.05)。突變體N542A、L544A、M547A的內(nèi)容物混合能力分別為野生型的248.5%、62.2%和12.6%,其它突變體的內(nèi)容物混合能力處于野生型F蛋白的95.8%~119.9%之間(P均大于0.05)。突變體L544A和M547A形成合胞體的大小與數(shù)目均有下降,其中M547A幾乎喪失了形成合胞體的能力,突變體N542A形成的合胞體的能力則大幅上升。除了M547A的表達(dá)水平有所降低之外(為野生型的66.3%),其它各突變體F蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)水平均處于野生型F蛋白的91.3%~111.4%之間(P均大于0.05)。由此可見,NDV F蛋白胞內(nèi)尾部N542、L544和M547為關(guān)鍵氨基酸,對(duì)F蛋白的融合活性起到了重要作用。