小鼠ERO1α基因慢病毒干擾載體的構建與鑒定

摘要：針對小鼠ERO1α基因構建短發卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒載體。根據NCBI中小鼠ERO1α基因序列,設計3條針對ERO1α的shRNA序列和1條陰性對照shRNA序列。將shRNA序列連接到慢病毒載體pCD513B-U6上,同時進行PCR鑒定及測序,分別命名為pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。將構建好的重組質粒和包裝輔助質粒共轉染HEK 293T細胞,包裝產生慢病毒。將所得病毒懸液進行濃縮,同時梯度稀釋轉導HEK 293T細胞,檢測病毒滴度。濃縮后的慢病毒轉導RAW 264.7細胞,通過RT-qPCR和Western blot技術進行有效片段的篩選。之后,將篩選的慢病毒轉到多種細胞系或者原代細胞,用RT-qPCR和Western blot技術檢測ERO1α基因的表達情況。PCR及測序結果表明,重組慢病毒干擾載體pCD513B-ERO1α-shRNA構建成功,所包裝的慢病毒其病毒滴度為5×10^7 TU/mL~10×10^7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot結果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表達的效果最好,干擾效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能夠轉導多種細胞,并顯著抑制ERO1α的表達,干擾效率在70%~90%。成功構建針對小鼠ERO1α基因的shRNA重組慢病毒載體,為進一步研究ERO1α功能奠定了技術基礎。