TagS750-Cas9核酸酶的制備及體內(nèi)代謝分布研究

摘要：Cas9核酸酶在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中執(zhí)行切割靶標(biāo)脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)的重要功能,研究其在體內(nèi)的代謝行為對活體水平的基因編輯具有重要的指導(dǎo)意義。本工作采用N-羥基琥珀酰亞胺酯鍵將近紅外熒光染料Vivo TagS750與Cas9蛋白偶聯(lián),制備了標(biāo)記率高達(dá)99%的TagS750-Cas9融合蛋白。采用熒光強(qiáng)度監(jiān)測以及瓊脂糖凝膠電泳的方法對Cas9蛋白在常見生理緩沖溶液中的穩(wěn)定性及切割活性進(jìn)行了鑒定,并將其尾靜脈注射到BALB/c小鼠體內(nèi),通過監(jiān)測TagS750-Cas9蛋白熒光強(qiáng)度的變化對其在體內(nèi)的代謝和分布進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:TagS750-Cas9蛋白的體外穩(wěn)定性良好,表面標(biāo)記的TagS750并不影響Cas9蛋白的切割活性。TagS750-Cas9蛋白進(jìn)入體內(nèi)后,平均血漿消除半衰期(t1/2β)為55 h;主要分布于肝、腎、肺、脾臟中,心臟的分布較少;72 h可被機(jī)體完全代謝清除。研究結(jié)果為CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9核酸酶的體內(nèi)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。