海島棉纖維均一化酵母雙雜交文庫的構建與GbTCP5互作蛋白的篩選

摘要：為探究轉錄因子在海島棉纖維中的生物學功能,以海島棉8個時期的纖維為研究對象,利用SMART技術合成ds-cDNA,經DSN進行均一化處理,構建以pGADT7為載體的海島棉纖維均一化酵母cDNA文庫,利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與海島棉GbTCP5互作的蛋白。根據克隆得到的GbTCP5基因的CDS區(qū)設計含有NcoⅠ、EcoRI酶切位點的引物,構建誘餌載體pGBKT7-GbTCP5。經自激活和毒性檢測后共轉化酵母菌株Y2HGold,篩選與GbTCP5互作的蛋白。實時熒光定量PCR顯示,GbTCP5基因在纖維發(fā)育起始期和伸長期的表達量較高,且在花瓣和花萼中的表達量高于其他組織。文庫的質量檢測顯示,構建的均一化cDNA文庫庫容為9.15×107 cfu·mL-1,重組率為100%,插入片段大小在500~2 000 bp之間。誘餌載體pGBKT7-GbTCP5通過酵母雙雜交系統(tǒng)多次篩選、回轉驗證,最終確定了4個互作的蛋白,分別是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海島棉纖維均一化cDNA文庫的構建和篩選,為進一步研究海島棉TCP轉錄因子及其互作蛋白在纖維發(fā)育時期中的作用機制奠定了基礎。