人早幼粒細胞cDNA文庫的構建及其鑒定

摘要：目的:構建人早幼粒細胞HL60的cDNA文庫,闡明文庫內(nèi)相關基因在急性早幼粒細胞白血病(APL)發(fā)生發(fā)展中的相關機制。方法:采用Trizol法提取HL60細胞總RNA,離心柱法分離純化樣本中的mRNA,逆轉(zhuǎn)錄PCR法合成cDNA第一鏈,酶促法直接合成cDNA第二鏈,膠回收目的長度的cDN段后將其與pPR3-N載體連接,通過同源重組方法在酵母Y187菌株中構建人早幼粒細胞cDNA文庫。將培養(yǎng)的菌液涂布于LB平板進行庫容量鑒定,PCR法鑒定插入片段大小及分布。結果:提取到的HL60細胞RNA條帶清晰無降解且彌散度低,以純化后的細胞mRNA為模板成功合成cDNA,經(jīng)膠回收cDN段后順利將其與pPR3-N載體連接。將重組載體轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y187,通過同源重組方法在菌株中成功構建人早幼粒細胞cDNA文庫。在原始電轉(zhuǎn)化菌稀釋100倍后取10μL涂板,共長約250個克隆子,庫容量為2.5×10^6CFU·mL^-1,轉(zhuǎn)化后原始菌液共計5mL,總庫容量為1.25×10^7CFU。文庫的插入片段電泳檢測,平均插入片段大于1200bp,陽性率為100%。結論:成功構建人早幼粒細胞的cDNA文庫,為白血病的發(fā)病機制及治療機制的研究奠定了基礎。