應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)制備Ace2基因敲除小鼠模型及基因型的鑒定

摘要：本研究旨在應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)高效構(gòu)建Ace2 (angiotensin-converting enzyme 2)基因敲除小鼠模型,并繁殖、鑒定及驗證Ace2基因敲除小鼠。通過構(gòu)建靶向敲除Ace2基因的載體,體外將Cas9 mRNA和向?qū)NA (guide RNA, gRNA)顯微注射到小鼠受精卵中,通過PCR和TA克隆測序?qū)π∈驛ce2基因的第3至18號外顯子刪除情況進行檢測和鑒定,繁育Ace2基因敲除小鼠并利用qRT-PCR和Western blot方法驗證獲得的Ace2-/Y小鼠主要臟器中Ace2 mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果顯示,順利構(gòu)建表達gRNA載體并體外轉(zhuǎn)錄,成功將有活性的gRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵,獲得6只陽性F0代初建鼠,PCR和基因測序鑒定表明成功刪除了小鼠Ace2基因的第3至18號外顯子;F0代鼠與野生型鼠回交,得到3只陽性F1代鼠,再與野生型鼠相交配得到的后代為F2代,在F2代中選擇Ace2-/+雌性雜合子鼠與野生型鼠交配,獲得F3代Ace2-/Y雄性純合子小鼠。qRTPCR和Western blot結(jié)果表明,F3代Ace2-/Y小鼠腎臟和肺中未檢測到Ace2 mRNA和蛋白表達。本方法通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了Ace2基因敲除小鼠模型,為進一步研究Ace2基因功能奠定了基礎(chǔ)。