基于瞬時表達系統的水稻miRNA靶基因快速驗證系統的建立

摘要：旨在建立一種準確且快速的基于瞬時表達系統的水稻miRNA靶基因驗證系統,為研究水稻miRNAs的生物學功能奠定基礎。已有研究證實osa-miR169o剪切靶基因OsNF-YA4(LOC_Os03g48970.1)的mRNA,以此為參照,在煙草和水稻原生質體瞬時表達系統中將miR169o前體基因分別與LUC表達載體、LUC-48970和LUC-48970m3融合表達載體瞬時共表達,通過CCD活體成像和Luminometor分析了共表達后LUC活性的動態變化。利用莖環qRT-PCR對miR169o的表達水平進行分析,獲得靶基因驗證的適合體系。在水稻原生質體體系中,LUC活性和miR169o表達水平在原生質體轉化后逐漸增高;24 h時LUC活性最高,相應miR169o表達水平上升10倍左右。綜合分析,在原生質體轉化后24 h-36 h為適宜檢測時間段。在煙草瞬時表達體系中,農桿菌注射72 h后LUC活性最強,而miR169o的表達在48 h后即可上調20倍。因此,農桿菌注射后48 h-72 h為適宜檢測時間段。本系統為水稻miRNA靶基因的驗證提供了一種簡便、快速,且更接近于體內真實情況的實驗方法。