三疣梭子蟹PtCrustin2抗菌肽基因優(yōu)化及其在畢赤酵母中高效表達(dá)

摘要：Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲殼動物來源的抗菌肽,是甲殼動物非特異性免疫機(jī)制中的重要免疫因子,其生物學(xué)功能由C端的成熟肽區(qū)域決定。參考三疣梭子蟹( Portunus trituberculatus ) PtCrustin2成熟肽的cDNA序列,根據(jù)畢赤酵母( Pichia pastoris )的密碼子偏愛性對其相關(guān)密碼子進(jìn)行優(yōu)化,合成5′端含 Xho Ⅰ限制性位點和Kex2信號肽酶切位點、3′端含 Xba Ⅰ限制性位點和6×his標(biāo)簽的目的基因“ smPtCrustin2 ”;以pPICZαA為表達(dá)載體,構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA- smPtCrustin2,將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33細(xì)胞后,通過含高濃度博來霉素的抗性平板篩選高拷貝甲醇利用快速型酵母轉(zhuǎn)化子;篩選獲得的酵母轉(zhuǎn)化子在28 ℃、250 r/min條件下,使用0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,并通過固化金屬離子親和層析(IMAC)對其進(jìn)行分離純化。Tricine-SDS-PAGE分析顯示:純化的重組體smPtCrustin2的分子量約為9.6 ku,并形成分子量約20 ku的二聚體。Western Blot分析進(jìn)一步證明了純化產(chǎn)物為預(yù)期的目的蛋白。建立的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得了表達(dá)量為22.4 mg/L的重組體smPtCrustin2。