煙草Hsc70-2的克隆及對馬鈴薯Y病毒侵染煙草的促進作用

摘要：【目的】馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是危害煙草、馬鈴薯、番茄、辣椒等主要農作物的重要病毒,給農業生產帶來巨大損失。論文旨在克隆Hsc70-2蛋白在本氏煙(Nicotiana benthamiana)中的基因序列并分析其生物學信息,研究NbHsc70-2蛋白對PVY侵染煙草的影響,為進一步解析PVY的侵染機制提供理論依據。【方法】以本氏煙為材料,克隆NbHsc70-2蛋白的基因編碼序列(coding sequence,CDS),利用MEGA 6.0進行多序列比對并構建系統進化樹;利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析NbHsc70-2在本氏煙各組織中的表達水平;采用在線軟件BaCeILo和SignalP 4.0對NbHsc70-2進行生物信息學分析;構建NbHsc70-2-RFP融合蛋白確定該蛋白的亞細胞定位;研究PVY處理對本氏煙葉片中NbHsc70-2的影響;利用激光共聚焦觀察PVY-GFP處理對NbHsc70-2-RFP定位的影響;構建NbHsc70-2 VIGS沉默體系及瞬時表達載體,采用qRT-PCR比較NbHsc70-2在沉默/過表達后對PVY表達的影響。【結果】NbHsc70-2編碼649個氨基酸,系統進化樹分析表明,NbHsc70-2與普通煙NaHsc70-2序列相似性最高,親緣關系最近,屬于熱激蛋白家族,C端具有熱激蛋白家族的高度保守基序結構;qRT-PCR分析表明,NbHsc70-2在葉中表達量最高,在根和莖中的表達量較低;BaCeILo預測及激光共聚焦顯微鏡觀察均顯示NbHsc70-2定位在細胞質中,并且PVY-GFP侵染本氏煙后NbHsc70-2-RFP部分轉移至細胞核,與PVY-GFP共定位在細胞質及細胞核中;將NbHsc70-2基因沉默載體pTRV::NbHsc70-2導入本氏煙中7 d后相比于對照組,沉默組出現心葉皺縮及矮化現象;接種PVY-GFP 7 d后通過手持紫外燈觀察到沉默組中無明顯綠色熒光出現,而對照組中PVY-GFP系統侵染使得非接種葉片呈現熒光現象,沉默組熒光點數約為對照組28%;接種PVY后,利用qRT-PCR檢測沉默NbHsc70-2后1、3、5 d的PVY CP基因積累量,結果表明沉默NbHsc70-2后PVY CP基因積累量下降,其中3 d和5 d與對照相