摘要：【目的】菌核病是由核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一類真菌病害,核盤菌寄主范圍廣泛,嚴(yán)重危害多種作物的品質(zhì)。本研究利用寄主誘導(dǎo)基因沉默(HIGS)的方法在寄主中誘導(dǎo)核盤菌致病相關(guān)基因的沉默從而增強寄主的菌核病抗性,為菌核病抗病育種提供新的思路。【方法】銅鋅超氧化物歧化酶是一種重要的抗氧化劑,以核盤菌銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶基因(copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS)為靶基因,通過生物信息學(xué)分析該基因的結(jié)構(gòu)特點,并利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;通過分別比對擬南芥及核盤菌基因組,選擇特異的干擾片段進行擴增;采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花序法,將HIGS載體轉(zhuǎn)入擬南芥Col-0,通過DNA鑒定以及標(biāo)記篩選出穩(wěn)定的HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥;選取4—5周齡的HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片接種核盤菌野生菌株1980,于接種24 h后統(tǒng)計病斑面積,分析轉(zhuǎn)基因株系的菌核病抗性;通過qRT-PCR分析核盤菌侵染轉(zhuǎn)基因植株過程中SsCCS的表達情況;同時在接種6、12、24 h后利用DAB染色的方法檢測轉(zhuǎn)基因植株與核盤菌互作過程中H2O2的積累。【結(jié)果】生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,SsCCS(SS1G_00102)全長為1010 bp,編碼序列長759 bp,共編碼253個氨基酸,該蛋白分子質(zhì)量為27176.96 Da,等電點(PI)為5.04,與灰霉病菌BcCCS(EDN25358)親緣關(guān)系最近,氨基酸同源性達到87%,與擬南芥AtCCS(AT1G12520.1)親緣關(guān)系較遠(yuǎn);通過與核盤菌以及擬南芥基因組比對,選擇314 bp特異干擾片段,成功構(gòu)建SsCCS的HIGS表達載體,轉(zhuǎn)化擬南芥。T1及T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥接種核盤菌24 h后的病斑面積均小于野生型擬南芥。從T2代中獲得3個穩(wěn)定表達的T3代HIGS-CCS轉(zhuǎn)基因擬南芥株系:HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;與野生型擬南芥相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥在接種核盤菌24 h后,病斑面積顯著減小46%—61%;qRT-PCR結(jié)果顯示核盤菌在侵染轉(zhuǎn)基因植株過?
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