鱟血G因子的原核表達

摘要：目的在大腸埃希菌中表達重組鱟血G因子,并檢測其酶活性。方法根據大腸埃希菌偏好性優化G因子成熟肽編碼序列,將G因子α亞基及β亞基克隆至原核表達載體pET32a-sumo上,分別構建pET32a-sumo/factorG-α及pET32a-sumo/factorG-β原核表達質粒,轉化E. coli BL21(DE3),IPTG誘導表達;產物經Ni-NTA親和層析,SUMO蛋白酶切割融合伴侶,獲得重組目的蛋白factorG-α及factorG-β;將二者等摩爾質量重組獲得復合物G,熒光底物Boc-Glu-(OBzl)-Gly-Arg-MCA檢測其酶活性。結果經PCR及測序鑒定,重組質粒pET32a-sumo/factorG-α及p ET32a-sumo/factorG-β構建正確;表達蛋白均以包涵體的形式存在沉淀中,表達量占菌體總蛋白的30%及45%;純化的factorG-α及factorG-β蛋白相對分子質量約為74 000和31 000,每1 L LB培養基酶切回收蛋白分別為0. 7和1. 7 mg。factorG-α及factorG-β蛋白與熒光底物幾乎不反應,而復合物G可與熒光底物反應產生較高的熒光強度。結論成功表達了具有酶活性的鱟血G因子,為進一步探討鱟血G因子的生物學功能及新型真菌感染檢測試劑盒開發奠定了基礎。