重組酶介導的隱孢子蟲屬特異性等溫核酸擴增方法的建立及評價

摘要：目的建立一種可用于隱孢子蟲檢測的重組酶介導的等溫核酸擴增(RAA)方法,并對其檢測敏感性和特異性進行評價。方法以隱孢子蟲屬特異性18S rRNA核酸序列作為檢測靶標,采用Amplfix軟件設計、合成引物及熒光檢測探針,構建并優化RAA熒光反應體系;分別以不同拷貝數的含18S rRNA靶序列的重組質粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA及不同數量隱孢子蟲卵囊基因組DNA為模板進行RAA熒光法檢測,以評價其敏感性;分別以隱孢子蟲卵囊、藍氏賈第鞭毛蟲包囊、日本血吸蟲蟲卵、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲蟲卵、沙門氏菌、志賀氏菌基因組DNA為模板進行RAA熒光法檢測,以評價其特異性。結果成功建立了隱孢子蟲檢測RAA法,該方法可在39℃、20 min內得到隱孢子蟲屬18S rRNA基因片段的有效擴增。以不同拷貝數的含18S rRNA靶序列的重組質粒、不同濃度隱孢子蟲卵囊基因組DNA及不同數量隱孢子蟲卵囊基因組DNA為模板,該方法最低檢出限分別為102拷貝/μL、1 pg/μL和1個/50μL;以藍氏賈第鞭毛蟲包囊、日本血吸蟲蟲卵、似蚓蛔線蟲蟲卵、華支睪吸蟲蟲卵、沙門氏菌、志賀氏菌基因組DNA為模板的熒光RAA擴增結果均為陰性。結論成功建立了一種可用于檢測隱孢子蟲卵囊DNA的RAA法,該方法操作簡便、反應快速,敏感性和特異性均較好。