小干擾RNA特異性沉默CD44基因對羧甲基殼聚糖保護大鼠軟骨細胞凋亡的影響

摘要：目的探討小干擾RNA（siRNA）沉默大鼠軟骨細胞的CD44基因后對細胞CD44基因表達的抑制作用及對軟骨細胞在羧甲基殼聚糖（CMCS）作用下細胞生物學特性變化及其作用機制。方法構建針對CD44基因特異性的siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3），Lipofectamine“2000轉染軟骨細胞。通過免疫熒光鑒定cD44基因特異性siRNA（CD44-siRNA）的轉染情況，通過反轉錄-聚合酶鏈反應（FIT—PCR）及蛋白印跡法檢測CD44-siRNA轉染細胞中CD44基因及蛋白的表達情況；通過硝普鈉誘導軟骨細胞凋亡并通過流式細胞技術檢測CMCS對硝普鈉誘導正常及經CD44-siRNA轉染軟骨細胞凋亡的影響。采用單因素方差分析及SNK—q檢驗對結果進行統計學分析。結果免疫熒光檢測發現CD44-siRNA成功轉染進入軟骨細胞，轉染率在60％左右。RT—PCR檢測結果表明，轉染siRNA-1后的24、48及72h，與空白對照組（0．429±0．053，0．501±0．037，0．341±0．009）相比，CD44的mRNA表達明顯減弱（分別為0．198±0．007，0．211±0．016，0．153±0．005；q=5．93，7．01，11．23；P〈0．01）。蛋白印跡法檢測表明轉染siRNA-1后24h，與空白對照組相比，CD44的蛋白表達明顯減弱（0．231±0．064與0．675±0．113，q=13．09，P〈0．01）。流式細胞檢測結果表明3mmol／L硝普鈉可以成功誘導軟骨細胞發生早期凋亡[（70±6）％]；50、100、200μg／mlCMCS對硝普鈉誘導的凋亡有-定的抑制作用[凋亡率分別為（51±7）％，（30±4）％，（15±4）％；q=5．08，6．97，9．73；P〈0．01]；但CMCS對硝普鈉誘導的CD44-siRNA-1轉染的軟骨細胞的凋亡抑制作用比未轉染組明顯減弱[凋亡率分別為（34±6）％和（15±4）％，q=6．95，P〈0．01]。結論CD44特異性siRNA-1轉染體外培養的大鼠軟骨細胞能顯著下調CD44基因的表達；CD44基因在CMCS保護硝普鈉誘導軟骨細胞凋亡中發揮重要的作用。