摘要：目的:通過構(gòu)建和比較經(jīng)Wnt5a基因修飾的巨噬細胞分別與骨髓干細胞(MSCs)2D單層貼壁與骨髓液跨小室共培養(yǎng)模型,旨在探索Wnt5a信號通過調(diào)控巨噬細胞炎癥反應(yīng)對MSCs成軟骨分化產(chǎn)生的影響.方法:自2015年9月至2018年12月收集6例重度膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎擬行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)者的巨噬細胞、MSCs和骨髓液,其中男2例,女4例;年齡58~71歲.膝關(guān)節(jié)囊滑膜組織常規(guī)消化取得單細胞,經(jīng)反復(fù)貼壁并行Ficoll液密度梯度離心和抗CD14抗體流式細胞術(shù)測定巨噬細胞純度.將上述經(jīng)鑒定的巨噬細胞置于IFN-γ聯(lián)合TNF-α刺激48 h后,再使用重組腺相關(guān)病毒(rAAV)-lacZ或Wnt5a轉(zhuǎn)染24h,分別與MSCs 2D單層貼壁或骨髓液構(gòu)建跨小室共培養(yǎng)模型,采用HE染色、軟骨特殊染色、X-gal染色、抗Wnt5a、抗Ⅱ和Ⅹ型膠原免疫組化染色對細胞形態(tài)與增殖能力、病毒轉(zhuǎn)粢效率和成軟骨分化能力等進行檢測.結(jié)果:抗CD68免疫組化顯示骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織巨噬細胞明顯增多.抗CD14流式細胞術(shù)證實經(jīng)分離的滑膜巨噬細胞純度為90.31%,IFN-γ聯(lián)合TNF-α刺激后發(fā)現(xiàn)上清液中單核細胞趨化素蛋白-1(MCP-1)水平明顯升高,提示巨噬細胞被激活;rAAV-lacZ轉(zhuǎn)染3d后,Ⅹ-gal染色發(fā)現(xiàn)其能有效轉(zhuǎn)染巨噬細胞,效率高達97.50%,且至少持續(xù)21 d;rAAV-Wnt5a轉(zhuǎn)染巨噬細胞后通過刺激其Wnt5a的表達,而增加兩種模型中的Wnt5a表達,抑制MCP-1的分泌,兩種模型中Wnt5a組MCP-1表達量分別為14.76和61.51 pg/ml;此外,rAAV-Wnt5a轉(zhuǎn)染后能促進細胞增殖及成軟骨分化、軟骨基質(zhì)合成.結(jié)論:在巨噬細胞與MSCs 2D單層貼壁或骨髓液跨小室共培養(yǎng)條件下,rAAV介導(dǎo)的Wnt5a過表達能通過影響巨噬細胞炎癥反應(yīng)而促進軟骨穩(wěn)態(tài)的維持以及MSCs成軟骨分化,巨噬細胞可能通過Wnt5a信號影響軟骨穩(wěn)態(tài)與MSCs成軟骨分化.
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