基因治療的基本策略

導語：在基因治療的基本策略的撰寫旅程中，學習并吸收他人佳作的精髓是一條寶貴的路徑，好期刊匯集了九篇優秀范文，愿這些內容能夠啟發您的創作靈感，引領您探索更多的創作可能。

第1篇

【關鍵詞】 CDTK基因;視網膜母細胞瘤;自殺基因治療;5FC;GCV

Abstract

AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.

METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.

RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P

CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.

KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV

自殺基因治療是近年來腫瘤研究的熱點領域之一，也是目前最有可能有效應用于臨床的腫瘤基因治療策略之一。構建安全高效的載體是基因治療的關鍵。我們已經成功的構建了含有hTERT啟動子的腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK[1]。我們將探討該載體對人視網膜母細胞瘤Y79細胞在體外的作用。

1材料和方法

1.1材料

Y79細胞株[美國模式菌種收集中心(ATCC)];RPMI1640細胞培養基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL試劑盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);雙丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白質Marker(上海生化試劑公司);實驗所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。

1.2方法

將經過證實的含有pcChCDTK質粒的JM109菌液0.2mL接種到200mL含50mg/L氨芐青霉素的LB培養基中，37℃，280r/min的搖床上培養16h，將菌液轉移到離心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步驟進行操作提取質粒pcChCDTK，干燥后，加無菌水溶解質粒300μL，用Duc 640分光光度計測定DNA含量，20℃分裝保存。用RPMI1640培養液培養Y79細胞，每日在倒置相差顯微鏡下觀察。Y79細胞懸浮生長，培養中細胞可聚集成團并沉集于培養瓶底部，當細胞基本鋪滿瓶底即可傳代，按照1∶2～1∶4傳代。將傳代后的Y79細胞培養24h后，細胞進入對數生長期，即可用于電轉化。未轉染Y79細胞生長迅速，傳代后培養24h后，細胞進入對數生長期。取上述進入對數生長期并基本鋪滿瓶底的細胞，在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細胞。用0.01mol/L PBS 10mL重懸細胞，取細胞懸液20μL，用細胞計數板計數，其余細胞在22℃，1000r/min條件下，離心10min，重新收集細胞;根據計數結果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重懸細胞。取800μL細胞重懸液加入到含有pcChCDTK質粒20μg的EP中，吹打混勻，然后轉入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進行電擊。電擊后，迅速將電擊產物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液的75cm2培養瓶中，置37℃，50mL/L CO2的細胞培養箱內培養。電轉染后的Y79細胞生長與未轉染細胞相似。倒置相差顯微鏡下見細胞懸浮生長，形狀飽滿，色澤鮮亮，聚集成團。

1.2.1 CDTK基因表達的檢測

提取Y79細胞RNA;參照reverse transcription system kit進行RTPCR反應;取逆轉錄產物2μL作為模板，以yCDrt和TKrt為引物擴增CDTK，同時用βactin擴增引物作對照，RTPCR產物用8g/L瓊脂糖凝膠跑膠檢測。另取未轉染的Y79細胞設為對照，同法處理。取轉染48h和未轉染的Y79細胞預處理;固定玻片;配制分離膠和堆積膠;上樣;跑膠;轉膜;封閉;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;顯色;曝光。

1.2.2 5FU濃度的檢測

人視網膜母細胞瘤細胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養液在37℃，50mL/L CO2細胞培養箱中正常培養。細胞在轉染腫瘤特異性殺傷載體pcChCDTK前24h換液，調整細胞密度使之在轉染時達基本鋪滿瓶底。將細胞在22℃，1000r/min的條件下，離心10min，收集細胞，用適當體積的無血清的RPMl1640培養液重懸，細胞計數，使之密度為6.25×109/L。取細胞懸液800μL加入自殺基因載體pcChCDTK 20μg，將其混勻，轉入0.4cm的電擊杯中，以2kV，25μF的條件進行電擊。電擊后，細胞接種入培養瓶中培養，24h后收集細胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養液配成細胞懸液，以每孔2×105個細胞的濃度植入24孔板，每孔培養液體積1mL。24h后加入前體藥物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其細胞上清，用高效液相色譜儀(HPLC)檢測其5FU的濃度。配5FC及5FU標準品的濃度梯度做標準曲線。LC10A高效液相色譜儀;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);預柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流動相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;檢測波長266nm;柱溫37℃。10μL進樣。

1.2.3前體藥物對細胞毒性的檢測

采用Western Blot技術檢測新融合自殺基因CDTK在視網膜母細胞瘤Y79細胞中的蛋白質水平表達。人視網膜母細胞瘤細胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培養液在37℃，50mL/L CO2細胞培養箱中正常培養。以2×105個細胞的密度將細胞接種到96孔板中培養，每孔體積200μL。24h后，加入不同濃度的前體藥物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每個濃度梯度有4孔。留1孔不加細胞，只加培養液做空白對照孔。在37℃，50mL/L CO2的條件下，細胞不換液培養5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，繼續孵育4h，終止培養，吸去培養上清液。每孔加入DMSO 150μL，振蕩10min，使結晶物充分溶解。比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上調定各孔吸收值。以每天進行換液的細胞做對照，假設細胞存活率為100%，將其它各細胞孔的吸收值與其比較得出各處理組細胞的平均存活率。另視網膜母細胞瘤細胞在轉染前24h換液，調整細胞密度使之在轉染時達基本鋪滿培養瓶底。將pcChCDTK載體電轉染Y79細胞。電擊后，細胞接種入培養瓶中培養，24h后，收集細胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培養液配成細胞懸液，以每孔2×105個的密度植入96孔板中培養，每孔體積200μL。24h后加入不同濃度的前體藥物100μL，5FC+GCV以兩藥的對應濃度加入96孔板，每個濃度梯度有4孔。留一孔不加細胞，只加培養液做空白對照孔。然后用MTT法檢測細胞存活率。統計學分析：所得數據用SPSS 11.5統計軟件包進行統計，采用StudentNeuman Keuls(SNK)檢驗，以P

2結果

2.1 Y79細胞轉染后CDTK基因的表達

RTPCR檢測結果顯示，轉染組可見一403bp特異條帶，與預期大小一致(圖1)。而在未轉染的對照組細胞中，未擴增出403bp特異條帶。在兩組中均擴增出作為內對照的βactin產物561bp條帶。分析結果顯示：大小為42kD的內參βactin蛋白條帶在轉染和未轉染的Y79細胞中均可見，一個大小為59kD的條帶，在轉染了pcChCDTK載體的Y79細胞中可見，這與yCDTK基因序列分析的預期蛋白大小一致，為自殺基因yCDTK蛋白。未轉染pcChCDTK的Y79細胞中則沒有59kD的條帶出現(圖2)。

2.2 Y79細胞轉染后5

FC轉化效率 加5FC 24h后上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，5FC向5FU的轉化效率約為84.5%。

2.3前體藥物對Y79細胞的毒性

將生長良好的人視網膜母細胞瘤Y79細胞，按每孔2×105個細胞接種到96孔板中培養。加入不同濃度的前體藥物5FC培養5d，平均細胞存活率分別為98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK檢驗表明，各梯度間的細胞存活率存在顯著性差異(P

2.4前體藥物對用腫瘤殺傷載體轉染的人視網膜母細胞瘤細胞的毒性檢測

將電轉了pcChCDTK的人視網膜母細胞瘤細胞，按相同的密度將細胞接種到96孔板中培養。加入不同濃度的前體藥物5FC培養5d，平均細胞存活率分別為94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK檢驗表明，各梯度間的細胞存活率存在顯著性差異(P

3討論

目前，相對于傳統的視網膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)治療方法而言，RB基因治療不僅可以彌補光凝固治療、光動力學治療、溫熱治療、冷凍治療的應用局限性，而且不會產生諸如化學治療、放射治療的副作用，更不會因為眼球摘除所導致的致殘性而造成患兒心理障礙影響生圖1RTPCR產物凝膠電泳圖 M:DL2000 Marker;1:轉染組可見預期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未轉染組;3:陰性對照。圖2Western Blot檢測CDTK的表達 A：1，2:βactin(42kD);B：1:轉染pcChCDTK的Y79細胞，出現一條約59kD蛋白;2:未轉染的Y79細胞。

存質量。因此，RB基因治療的研究越來越為人們所重視，并且通過不同的治療策略取得了一系列的研究進展。現階段對RB基因治療的研究主要集中在4種不同的基因上，包括自殺基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB發生的分子機制還不是太清楚，而且與RB形成相關的抑癌基因凋亡誘導基因種類繁多，與腫瘤血管形成相關的誘導因子和抑制因子多種多樣，且分子機制仍有待于進一步研究。我們選擇雙自殺基因CDTK作為目的基因，實施RB的自殺基因治療。首先，自殺基因作為腫瘤基因治療的候選基因，已經在多種腫瘤開展研究[27]。其表達產物和前體藥物相互作用來實現腫瘤基因治療的機制比較清楚。其次，自殺基因和前體藥物相互作用產生的毒性物質能通過不同方式實現對鄰近腫瘤細胞的旁殺效應，包括直接分泌到細胞外旁殺，或通過細胞間隙連接旁殺，或通過產生凋亡小體、免疫介導來實現旁殺。同時，目前的研究表明，自殺基因系統治療RB是安全有效的[8]。我們設計的含有雙自殺基因CDTK的載體通過電轉染的方式導入了視網膜母細胞瘤細胞株Y79細胞。48h后，提取轉染Y79細胞RNA，RTPCR的結果可見一403bp特異條帶，與預期大小一致，顯示雙自殺基因CDTK在細胞中mRNA水平得到了表達。Western blot的結果也同樣顯示，載體轉染的Y79細胞中，59kD的目的基因蛋白有明顯的表達。這兩個實驗結果充分說明，我們構建的雙自殺基因CDTK在靶細胞Y79中得到表達。先前的研究顯示，被設計得的融合基因yCD/UPRT、大腸桿菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最強的催化前體藥物向細胞毒物轉化的能力。我們通過HPLC檢測5FU的濃度，上清中5FU的濃度平均含量為169mg/L，故5FC向5FU的轉化效率約為84.5%，說明我們所構建的腫瘤特異性雙自殺基因載體具有很強的催化前體藥物向細胞毒性物質轉化的能力。

雙自殺基因療法是將兩種自殺基因整合在一起，通過載體轉導進入腫瘤細胞，其在腫瘤細胞內表達的融合基因產物具備兩種酶的活性。因此，雙自殺基因療法可以大大提高抑制腫瘤生長的功效，同時使得前體藥物的用量減半。大量資料表明雙前體藥物對腫瘤細胞的殺傷作用要強于單前體藥物。但也有資料顯示雙自殺基因之間可能存在拮抗效應。在體外實驗中，單獨加5FC的細胞殺傷最強，要高于5FC和GCV都加的組，而單獨加GCV的細胞殺傷力最低， CD和TK之間沒有協同作用，反而可能會相互干擾各自功能的運行。原因可能有兩個方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同時加5FC和GCV時，CD/5FC和TK/GCV兩種系統的功能出現拮抗效應;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某種原因，CD和TK的活性在這個融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV兩種系統的抑瘤能力同時或其中一種得到增強。當E.coli CD和HSV1 TK基因同時在一種細胞中表達時，會存在相互干擾作用。這種干擾作用的機制到目前還沒搞清楚，但干擾作用可能不是發生在基因的轉錄期，而是在轉錄之后，TK介導的5FUMP的磷酸化會產生無毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性產物5FUDP和5FUTP，從而減低了CD/5FC的細胞毒性作用;或者CD介導的對GCV，ACV等的脫胺反應減低了TK/GCV系統的細胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性與單獨的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于單獨CD酶活性100倍。這種酶活性的改變可能與這3種酶的蛋白質特性不同有關。加入不同濃度的前體藥物5FC，GCV或5FC+GCV于電轉了pcChCDTK的人視網膜母細胞瘤Y79細胞培養5d， SNK檢驗表明，與未轉染的細胞對應濃度組比較，當5FC濃度達到100mg/L后各對應濃度平均細胞存活率組間均存在差異(PGCV >5FC。在本實驗中，單前體藥物對雙自殺基因CDTK載體轉染的Y79細胞均有殺傷作用，但雙前體藥物的殺傷作用要強于單前體藥物。分析產生這種結果的原因，我們認為：(1)雙自殺基因載體具有很強的催化前體藥物向細胞毒物轉化的能力;(2)這可能與我們加入的CMV增強子能大大促進hTERT啟動子啟動下游目的基因的表達有關，因為CMV增強子具有強大的增強轉錄能力，且沒有組織特異性。

參考文獻

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3陳海金，蘇國強，黃宗海，等.慢病毒介導的雙自殺基因對乳腺癌細胞的殺傷作用.廣東醫學2006;27(7)：965967

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第2篇

關鍵詞：非小細胞肺癌；中醫；西醫；治療進展；展望

中圖分類號：R273文獻標識碼：A

文章編號：1007-2349（2011）11-0085-03

非小細胞型肺癌（nonsmallcelllungcancer，簡稱NSCLC），是發生于肺部的常見癌癥。根據病理學組織結構，可分為鱗癌、腺癌、大細胞癌等不同類型，約占肺癌總數的80~85%[1]。目前治療以西醫治療為主，其中以手術治療、放療、化療為主要治療手段。中醫作為輔助療法不但可減輕放、化療所致的毒副作用，而且有利于放、化療順利進行，在延長生存期等方面取得了較為滿意的療效。從總體治療效果看，NSCLC的臨床治療已取得很大進展。本文就NSCLC的臨床中西醫治療進展與展望作一綜述。

1外科治療

11一般手術治療一般手術治療仍然是目前治療早期非小細胞肺癌最理想的方法。手術方法有肺葉切除、一側全肺切除、袖式肺葉切除、氣管隆凸再造、氣管-肺動脈成形術等手術方法。同時需高度重視淋巴結清掃，只有通過系統肺門和縱隔淋巴結清掃才能達到完全切除和標準分期的目的。

12微創胸外科手術治療目前，肺癌微創外科技術主要有3種手術方式，即視頻輔助胸腔鏡手術（video-assistedthoracoscopicsurgery，VATS）、機器人輔助胸腔鏡手術（robot-assistedthoracoscopicsurgery，RATS）和保護胸壁肌肉的小切口開胸手術（muscle-sparingminithoracotomy，MSMT）。（1）VATS：目前中國多家胸外科中心已開展VATS肺癌切除術，在2008年第8次全國胸心血管外科學術會議上，華西醫院劉倫旭介紹了更具有操作性、更加規范的“單向式胸腔鏡肺葉切除術”，標志著中國VATS肺癌切除術的成熟。（2）RATS：近年，機器人已被引入外科手術中，這揭示了未來胸外科的發展趨勢和方向[2]。2006年美國紐約紀念醫院[3]報告了34例RATS肺葉切除的臨床資料，無手術死亡，4例（12%）中轉開胸，平均清除4組淋巴結，中位手術時間218min，中位胸腔引流時間3d，中位住院時間45d。（3）MSMT：隨著器械外科技術的進步和小切口下手術操作技巧的提高，經MSMT可方便地施行與傳統開胸手術相同的解剖性肺切除和系統淋巴結清掃，已能對絕大多數具備手術適應證的肺癌實施根治性切除，獲得與傳統后外側切口肺癌切除術相同的治療結果。

2化療

目前化療方案大致可分為兩類：以鉑類藥物為基礎的雙藥聯合方案和不含鉑類藥物的方案。（1）以鉑類藥物為基礎的雙藥聯合方案是目前治療NSCLC較常用的一種手段，藥物的組合方式也有多種，鉑類聯合新藥是目前治療的首選方案[4]。對于有良好預后因素的晚期NSCLC患者采用聯合順鉑與健澤、紫杉醇、異長春花堿化療取得了令人滿意的有效率；對于沒有良好預后因素或老年患者，采用異長春花堿、健澤或紫杉醇單藥治療更為合適[5]。（2）不含鉑類藥物的方案藥物主要是紫杉醇、多西他賽、泰素帝、吉西他濱等。目前最引人注目的方法是“TXT”（泰索帝）75mg/m2（毫克每平方米體表面積）單一藥物治療[6]。

3放療

根據目前的研究，放療可分為術前放療、術中放療和術后放療3種方法。術前放療的目的為清除手術區域以外的亞臨床病變，減小腫瘤體積以及相鄰組織之間的浸潤，減少局部種植和轉移的機會，以提高切除率和生存率。但是臨床實踐顯示上述目的未能達到，并沒有使患者受益，臨床上已不常規采用[7]。術中放療的目的是降低局部復發率，是近年發展的在手術殘留部位以電子線進行的一次性大劑量（15gy～25gy）照射，手術傷口愈合后再行體外高能放療。術后放射治療可提高生存率，對于手術中癌腫組織未能全部切除或支氣管斷端殘留癌浸潤的病例可放置金屬標記行放療。

4分子靶向治療

分子靶向治療比傳統的化療具有更高的選擇性，毒副作用小，是今后腫瘤治療的新趨勢[8]。目前臨床應用的分子靶向治療藥物主要有以下3類：（1）作用于表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑是一種跨膜蛋白，為原癌基因EerB1（Her21）的表達物。這類藥物包括易瑞沙和埃羅替尼等多種藥物。（2）作用于血管生成的靶向藥物是一種重組人源化抗血管內皮生長因子單克隆抗體，由培養在含慶大霉素培養基中的中國倉鼠卵巢哺乳細胞表達體系生產。這類藥物主要有貝伐單抗等。（3）多靶點治療藥物是一種口服多靶點治療藥物，能選擇性地抑制血管內皮生長因子依賴的腫瘤血管形成，而且對表皮生長因子受體也有一定抑制作用。這類藥物有ZD6474等。

5免疫治療

51主動免疫療法主要有非特異性主動免疫療法和特異性主動免疫療法。（1）非特異性主動免疫療法：目前主要應用具有免疫調節作用的刺激因子通過非特異性的作用激發機體的免疫系統，增強抗腫瘤的免疫應答。如卡介苗、短小棒狀桿菌、左旋咪唑等，也可用細胞因子如白介素-2、白介素-4、干擾素、腫瘤壞死因子等。但由于肺癌的腫瘤抗原性不強，目前這種治療難以取得明顯效果。（2）特異性主動免疫療法：隨著對腫瘤免疫研究的深入，腫瘤疫苗和抗獨特性抗體作為疫苗的發現使特異性主動免疫療法成為可能[9]。某些抗獨特性抗體與抗體上的抗原相關位點結合，能夠模擬外來抗原，作為免疫治療中替代性抗原。

52被動免疫療法主要有過繼免疫療法和抗體療法。（1）過繼免疫療法：目前肺癌的過繼免疫療法可以應用淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）輸入體內或局部應用于癌性胸水，對延緩病情的發展有一定的效果，但單獨應用治療效果不佳。還可以應用腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL），通過基因修飾的TIL進行治療。實踐證明TIL的療效比LAK要更好。（2）抗體療法：目前抗體療法正成為肺癌的另一研究熱點，它已成為肺癌綜合治療的一部分。運用相應的單克隆抗體與異常表達的癌基因產物結合可以阻斷癌細胞的異常信號傳導通路，從而阻止癌癥的發展[10]。

6介入治療

目前介入治療在NSCLC應用的方法主要有兩種，即經支氣管動脈灌注化療和支氣管栓塞治療。經支氣管動脈灌注化療可有效提高腫瘤局部藥物濃度，提高抗癌藥物的解毒作用，同時又可以減少或阻斷腫瘤的血供，使其縮小、壞死。支氣管栓塞治療可通過介入放支架解除腫瘤引起的中心氣道狹窄或阻塞，對繼發于肺癌的上腔靜脈綜合征患者血管內置人支架是較好的方法。

7基因治療

基因治療在該病所應用的方法主要有[11]誘導特異性免疫的基因治療和直接作用的基因治療兩種。誘導特異性免疫的基因治療即輸送生物活性基因來改變癌細胞的局部免疫環境，增加癌細胞的免疫原性和T細胞的反應性，改善抗原提呈和提供缺失的旁分泌。由于免疫性誘導是遺傳性系統性的，同時靶子來源于腫瘤抗原，因此所誘導的免疫性具有潛在發現和殺死沒有經過基因修改的腫瘤細胞。這一特點可能對以遠處轉移為主要問題的肺癌具有重要意義。直接作用的基因治療主要有抑癌基因的治療、藥敏感性基因治療和反義cDNA和寡核苷酸技術3種方法。

8中醫藥治療

中醫學側重辨證施治，從整體調節入手，目前中醫藥在治療肺癌中，特別是在NSCLC的防治方面主要有以下作用：（1）防治手術、放療、化療副反應；（2）配合手術、放療、化療減毒增效；（3）在抗非小細胞肺癌復發和轉移的綜合治療中起很重要的作用；（4）不能手術、放療，不宜再化療的肺癌患者，中醫起主導作用，即改善癥狀、提高生存質量、延長生存期[12]。

81病因病機中醫學認為，肺癌屬“肺積”“痞癖”“咳嗽”“咯血”“胸痛”等范疇，病位在肺。學者們對其病因病機雖然有不同的認識，但無外乎正氣虛損和邪毒內積兩個方面，本病病變部位在肺，與脾、腎有關，病理因素主要為氣滯、痰濁、瘀血、熱毒，病理性質為本虛標實，虛實錯雜。在治療過程中，扶正培本為其關鍵。

劉麗坤等[13]認為，肺癌的基本病機為正虛邪實。正虛是肺癌發生的基礎，是復發、轉移的關鍵，其中肺陰虧虛貫穿疾病的始終，痰瘀毒結是肺癌的主要病理表現。劉嘉湘認為肺癌總屬本虛標實，由于正氣先傷，邪氣得以乘虛而入，聚積于肺，導致氣滯血瘀、聚液為痰、痰瘀交阻而漸成腫塊。高萍等認為放化療副反應是毒邪內侵，損害肝脾腎等臟腑功能，耗傷機體氣血津液，導致氣血陰陽的失調與缺失。

82辨證分型中醫將肺癌看作是全身性疾病的一個局部表現，主要根據癥狀和體征對肺癌進行辨證分型，治療上強調全面調整人體機能。目前主要依據陰陽盛衰、氣血的虛實、臟腑病機以及邪毒性質進行歸類分型。這些證型基本反映了肺癌病情發展不同階段的一些規律。劉嘉湘對405例非小細胞肺癌病例進行研究，其中陰虛和氣陰兩虛型占肺癌的726%，指出肺癌的病機特點以陰虛和氣陰兩虛為主。楊國旺等將肺癌劃分為氣虛、陰虛、陽虛、血虛、痰濕、血瘀、毒熱7個基本證型。李忠等研究發現以氣陰兩虛及痰瘀互阻證型最為常見，其他依次為脾虛痰濕、肺脾氣虛、氣虛血瘀、痰濕阻滯等。孫士玲分為肺脾氣虛、肺，胃陰虛、肺熱痰濕、氣滯血瘀型。

83中成藥中醫藥作為一個輔助療法，在非小細胞肺癌的治療中起到了很大的作用。隨著中藥制劑現代化研究，研制成了很多中成藥，有很好的臨床療效。目前臨床上使用的口服中成藥有固本消瘤膠囊、乾坤膠囊、平消膠囊、抗瘤沖劑、仙露沖劑、中成藥鶴蟾片、參一膠囊等。治療NSCLC的中藥靜脈制劑主要有康萊特注射液、參麥注射液、丹參注射液、艾迪注射液、華蟾素、欖香烯、巖舒注射液等。

9回顧與展望

非小細胞肺癌的手術、放療、化療和生物治療等在臨床治療上已經取得了很大的進步，但是治療效果仍不能令人滿意。中醫藥作為一個補充治療手段和方法正起到越來越重要的作用。中醫的整體觀從大局出發，提倡提高機體正氣抗邪，防止病情進展，正彌補了西醫重局部的不足。中醫藥治療肺癌的療效以病灶穩定率較高、生存期較長、改善生活質量較好為主要特點，在抗復發轉移，減負增效方面有一定的優勢，對于已無放化療機會晚期肺癌患者，中醫藥治療是緩解疾苦的主要手段。但是中醫治療在很多方面還不完善，比如辨證分型缺乏統一的認識，臨床應用個案報道數量較多，缺乏大樣本、多因素的觀察，循證醫學證據并不充分等。

筆者認為目前西醫治療一方面微創手術研究是未來外科手術的發展方向，另一方面靶向治療、免疫治療和基因治療都是肺癌多學科治療中新的研究和應用熱點，日益受到重視，是以后發展的方向。要注意提高藥物療效，降低毒副作用，延長患者（尤其是晚期肺癌患者）的生存期。中醫治療應從扶正祛邪，整體調節入手，應特別重視調補肺臟功能兼顧調整五臟功能。具體來說，整體方面要調理飲食，注意飲食平衡；調理藥物，注意藥物之間的平衡，勿太過不及；調理五臟功能，勿偏盛偏衰。局部方面要注意調整肺臟本身的功能和調整脾胃功能。中醫認為“人以胃氣為本”、“脾胃為后天之本，為氣血生化之源”，脾胃功能好壞對疾病的預防和治療都有很重要的作用，尤其在肺癌的防治中更是具有重要價值。未來該病的治療必將走上一條中西醫互補的道路，因而希望能夠多學科配合、大膽摸索、反復實踐，更好的發揮中西醫結合在NSCLC預防治療中的特色和優勢，從而對人類防治NSCLC整體水平的提高起到積極地推動作用。

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第3篇

【摘要】 目的: 探討黏著斑激酶(FAK)表達水平對結直腸癌細胞增殖及運動的影響。方法: 針對FAK基因不同靶點設計siRNA序列， 構建siRNA重組子， 轉染Caco2細胞， 以RTPCR和免疫細胞化學方法檢測FAK mRNA和蛋白表達變化及時間效應， 同時檢測FAK基因敲低對Caco2細胞的凋亡、 增殖及遷移的影響。結果: FAK siRNA導入Caco2細胞后， FAK mRNA和蛋白表達水平明顯下調， 細胞增殖及遷移能力受抑， 呈時間依賴關系， FAK mRNA水平下調在轉染后48 h達到最大。結論: FAK siRNA可有效抑制靶基因表達， FAK表達水平下調后Caco2細胞的增殖及運動明顯受抑制。

【關鍵詞】 小干擾RNA; 結直腸癌; FAK; 細胞增殖; 細胞運動

[Abstract] AIM: To investigate the effect of siRNA targeting FAK gene on proliferation and motility of colorectal cancer. METHODS: Recombinant plasmids that produced siRNAs targeting FAK were designed and cloned， then transfected into Caco2 cells. The changes of FAK expression levels were examined by RTPCR and immunocytochemistry. The effects of FAK gene knockdown on apoptotic morphological changes， proliferation， and motility were investigated. RESULTS: Recombinant plasmids targeting FAK were successfully constructed， FAK mRNA and protein level was silenced in Caco2 cells significantly. The inhibition of mRNA level was achieved maximal at 48 h post transfection with time dependent. The ability of proliferation and motility of Caco2 cells were significantly decreased. CONCLUSION: Plasmidmediated FAK siRNA could inhibit FAK gene expression. The proliferation， motility and apoptosis were inhibited effectively， which suggested that FAK expression is closely associated with the proliferation， motility and apoptosis， etc. The results may be used as the reference for gene therapy of colorectal cancer.

[Keywords]small interfering RNA; colorectal cancer; FAK; cell proliferation; cell motility

近年來以黏附相關因子為靶點的治療成為基因治療研究的新策略[1]， 黏著斑激酶(focal adhesion kinase， FAK)是近年來發現的細胞黏附介導的信號通路的重要因子， 作為胞內信號蛋白酪氨酸激酶， 于1992年被獨立鑒定為Src癌基因的底物。FAK的相對分子質量(Mr)為125 000， 定位于人染色體8q24， 與cmyc基因座接近， 此基因座在人癌細胞中往往被激活而強化[2]。FAK作為信號轉導的關鍵分子， 可傳遞由胞外到胞內的多種信號， 其在結腸癌中表達升高而在正常組織細胞中表達呈弱陽性的特點開始引起研究人員的關注[3]。有研究顯示， FAK基因在結直腸癌組織中表達升高[4]， 并與癌細胞增殖、 侵襲轉移密切相關， 但作用機制還不明確。本實驗將靶向FAK基因的siRNA表達載體導入Caco2細胞， 探索FAK siRNA對結直腸癌細胞增殖和遷移的影響并初步探討其作用機制， 為結直腸癌基因治療積累實驗資料。

1 材料和方法

1.1 材料 人結直腸癌細胞株Caco2購于美國ATCC。重組質粒pU6H1GFP/FAKsiRNA為本實驗室設計、 百奧生物技術有限公司(南通)構建， 大小為5.5 kb， 經測序正確。限制性內切酶Hind Ⅲ購自NEB公司。脂質體Lipofectamine 2000、 TRIzol試劑均為美國Invitrogen公司產品。RPMI1640培養基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Amresco公司。RT007 AMV反轉錄酶購自杭州博日科技有限公司。FAK、 GAPDH引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。針對FAK的單克隆抗體(mAb)購自Santa Cruz公司。SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司。Hoechst 33258購自南京凱基基因有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設計及構建 利用Ambion siRNA在線軟件設計了2條針對FAK的siRNA: siFAK1: 5′GGGCAGACGAGACCACACTGA3′; siFAK2: 5′GAAATGGAAGAAGATCAGCGCT3′; 錯義對照序列siRNASCR: 5′GCATCTAAGGTATCGTTGTGGCTC3′。經Blast比對證實與人其它基因無同源性后構建合成siRNA表達載體， 雙啟動子U6和H1之間插入人FAK及錯義siRNA靶序列。

1.2.2 細胞轉染 于6孔培養板， 將Caco2細胞接種于無抗生素、 含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養液， 細胞接種密度: 2×105/孔， 飽和濕度培養24 h。參照Lipofectamine 2000說明書進行轉染優化， 轉染后6 h更換完全培養基。實驗分為: 正常對照組(未轉染的Caco2)、 錯義siRNASCR組(非特異性siRNA轉染)、 干擾組siFAK1、 siFAK2。

1.2.3 GFP表達檢測及轉染效率評價 轉染后細胞于激發波長為488 nm的熒光倒置顯微鏡下檢測GFP的表達情況。以放大100倍的視野為標準， 計5個視野表達綠色熒光的細胞數和總細胞數， 求GFP表達率: GFP表達率=發綠色熒光細胞數/細胞總數×100%。

1.2.4 細胞凋亡形態學檢測 取對數生長期細胞以2×105/孔接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中， 每組爬片4張， 轉染48 h后棄培養液， PBS洗3次， 40 g/L多聚甲醛4℃固定15 min， PBS洗3次， 吸凈液體， 每孔加入200 μL Hoeschst 33258工作液， 避光孵育10 min， PBS漂洗封片， 熒光顯微鏡下隨機選取高倍視野進行拍照， 激發光波長為365 nm。

1.2.5 RTPCR檢測 收集轉染后24、 48、 72、 96 h細胞， 各組細胞總RNA按TRIzol試劑說明書提取。將總RNA(0.5 μg)行10 μL反轉錄體系。取cDNA再進行25 μL PCR反應。PCR循環參數為: 95℃預變性2 min; 94℃變性40 s， 46℃退火40 s， 72℃延伸1 min， 共28個循環(GAPDH: 18個循環)， 于72℃延伸10 min。FAK上游引物: 5′GCGTCTAATCCGACAGCA3′， 下游引物: 5′GCCGACTTCCTTCACCAT3′， 擴增產物為445 bp; 內參GAPDH上游引物: 5′AATCCCATCACCATCTTCCA3′， 下游引物: 5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′， 擴增產物為580 bp。各取5 μL擴增產物， 經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 凝膠成像儀下觀察結果及照相， BandScan 5.0進行條帶分析， 檢測各組FAK與GAPDH的灰度比值表示FAK mRNA表達水平變化， 比值越高說明目的基因表達越高。

1.2.6 細胞增殖檢測 調整細胞密度為6 000個/孔， 接種至96孔板， 設Blank組(只加完全RPMI1640培養液)、 siRNASCR組、 正常對照組、 干擾組(siFAK1、 siFAK2)， 每組每個時間點設6個復孔。培養24 h后棄上清， 進行轉染(脂質體: 0.5 μL， DNA: 0.2 μg)。于孵箱中繼續培養24、 48、 72、 96 h后每孔加入MTT(1 g/L)15 L， 37℃、 50 mL/L CO2避光孵育5 h， 再加入100 μL DMSO振蕩10 min， 酶標儀562 nm處測定各孔A值。生長抑制率=(1-處理組平均A值)/正常對照組平均A值×100%。

1.2.7 細胞遷移檢測 于6孔板內按上述方法進行轉染， 培養24 h后用外接真空泵的1 mL移液槍頭(直徑1.5 mm)垂直于6孔板板底分別打孔， PBS清洗2次， 更換完全培養液。分組同1.2.2， 40倍倒置顯微鏡下照相。于轉染后48、 72、 96、 120 h繼續照相， Gene Tools軟件測定每孔各時間點面積。遷移率=(1-該時間點損傷面積)/原始損傷面積×100%。

1.2.8 免疫細胞化學檢測 將細胞接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板中(1.5×105/孔)， 每組爬片4張。設陰性對照組(PBS代替一抗)、 siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1和siFAK2共5組。轉染48 h后取蓋玻片用SP試劑盒檢測， FAK mAb稀釋度為1∶300， 避光條件下， DAB顯色， 三蒸水沖洗停顯， 梯度酒精脫水， 二甲苯透明， 取出蓋玻片置于載玻片上， 胞質出現棕褐色為陽性染色。中性樹膠封片后， 每組隨機選取10個高倍視野(×200)， 進行圖像采集。

1.2.9 統計學分析 數據以x±s表示， 采用SPSS15.0軟件進行方差分析。P

2 結果

2.1 重組質粒pU6H1GFP酶切鑒定 用Omega無內毒素質粒小提試劑盒擴增并純化質粒， 經Hind Ⅲ 酶切鑒定， 可見質粒可被切割成大約5.5 kb的線性片段， 結果完全正確(圖1)。

2.2 轉染效率 經優化的脂質體條件轉染后， GFP表達率為(44.59±2.71)%。

2.3 細胞凋亡的形態學觀察 經Hoechst 33258染色可見正常對照組細胞染色質為彌漫均勻的低強度熒光， 無明顯凋亡特征(圖2A); 經siFAK1和siFAK2組轉染細胞48 h后， 細胞表現出典型的凋亡形態學變化， 胞核呈濃染致密的固縮形態、 斷裂成塊、 呈顆粒狀亮藍色熒光， 且有少量凋亡小體出現(圖2D、 E中箭頭所示)。脂質體組及siRNASCR組均沒有出現明顯的凋亡形態學改變(圖2B、 C)。因此可得出脂質體試劑及pU6H1GFP載體對轉染無明顯影響， 排除假陽性的干擾。

2.4 FAK mRNA表達變化 轉染Caco2細胞于24、 48、 72、 96 h后檢測siRNA敲低FAK mRNA水平表達的時間效應關系， 并確定敲低效果最好的1條序列。RTPCR結果顯示， 各組內相應內參GAPDH的條帶基本一致， siFAK1和siFAK2組FAK mRNA水平低于正常組和siRNASCR組， 且敲低效應在轉染后24～48 h范圍內呈時間依賴性降低， 至48 h降到最低(P

2.5 細胞增殖狀況 MTT法檢測表明， siFAK1和siFAK2組細胞增殖抑制率明顯增加(圖4)。與正常對照組相比， siFAK1和siFAK2對細胞增殖的抑制率在轉染后24～72 h均有統計學意義(P

2.6 細胞遷移狀況 與正常組相比， 特異性siFAK1、 siFAK2組使Caco2細胞的遷移率明顯降低(P

2.7 FAK蛋白表達變化 免疫細胞化學方法檢測結果顯示， 正常組FAK表達多位于胞質， 呈棕褐色， 強陽性表達， 而siFAK1、 siFAK2組細胞中FAK蛋白的表達明顯減弱(圖6)。ImagePro Plus 6.0圖像分析各組的A值， 轉染后48 h siRNASCR組、 正常對照組、 siFAK1及siFAK2光密度分析結果分別為0.223±0.006、 0.254±0.002、 0.059±0.006、 0.079±0.008。可見轉染后48 h兩個干擾組的蛋白表達明顯被抑制(P

3 討論

FAK作為Src癌基因的底物， 位于整合素富集的黏著斑處， 與多種信號分子相互作用， 介導多種細胞表面受體激活及信號傳輸來調控細胞骨架組建、 細胞增殖、 凋亡及存活、 細胞轉移及入侵等， 最終參與腫瘤的發生。有研究表明， 在正常結直腸上皮細胞中FAK表達呈弱陽性或陰性[5]， 這與維持上皮細胞的生理功能是不可缺少的; 而在結直腸癌相關的細胞中FAK表達明顯升高， 說明其表達上調可能是結直腸癌具有惡性表型的早期事件。因此， FAK作為腫瘤發生進程相關的關鍵分子可能成為腫瘤治療的靶點， 而抑制FAK的表達則有望成為腫瘤基因治療的新熱點。針對FAK基因的反義寡核苷酸治療結直腸癌的研究已有報道[6]。RNAi是近年來快速發展的一種高效的基因沉默技術， 并作為一種關鍵技術應用于抗腫瘤、 基因功能研究[7]。

本實驗以Caco2細胞為研究對象， 采用針對FAK mRNA的特異性siRNA重組表達質粒進行轉染。RTPCR顯示， 所設計的兩個siFAK重組質粒均能使其mRNA水平下降， 其中以siFAK1干擾效果更強， 在轉染后48 h敲低效果最明顯， 說明siRNA對FAK的抑制作用可能有時相性。而錯義組則沒有上述作用， 從而另一方面證明RNA干擾的特異性。同時免疫細胞化學檢測結果也顯示轉染后48 h siFAK1對細胞FAK蛋白抑制更明顯。

細胞增殖和遷移在多種惡性腫瘤的病理生理過程中起重要作用。有研究表明[8]， 活化的FAKRASMAPK是促進細胞遷移和增殖的重要信號通路。本研究中， 細胞增殖及遷移實驗表明， 靶向FAK基因干擾Caco2細胞后， 細胞貼壁能力降低， 變圓易脫落， 細胞的增殖及遷移明顯受抑， 因此我們推測FAK基因表達受抑可使FAKRASMAPK信號通路受阻， 最終導致細胞增殖及遷移能力降低， 提示FAK基因可能是結直腸癌腫瘤治療的一個新靶點。相反siRNASCR組對細胞的增殖及遷移無明顯影響， 因此可以斷定質粒載體pU6H1GFP可以作為安全有效的基因載體。近年來有關研究表明FAK與腫瘤細胞的凋亡相關。Huang等[9]發現FAK通過活化PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信號存活通路而引發NFκB活化， 最終阻斷caspase3級聯反應， 使細胞凋亡受抑。因此FAK的表達與凋亡密切相關。本實驗初步研究結果顯示， 通過Hoechst熒光染色發現siFAK轉染Caco2細胞48 h后細胞呈現凋亡的形態學變化: 核致密濃縮， 染色體斷裂， 并出現凋亡小體等特征。從分子機制來說， FAKsiRNA可能通過下調FAK mRNA和蛋白表達水平而促使Caco2細胞凋亡。

實驗中2個siFAK重組質粒對靶基因的抑制效應不同， 其中以siFAK1抑制FAK基因mRNA、 增殖及遷移的作用最為明顯， 這種針對同一基因的不同靶點而產生的不同干擾效果， 可能與位置效應有關[10]。因此說明利用RNA干擾進行腫瘤臨床治療要對干擾序列進行篩選。

綜上所述， FAK與腫瘤的發生、 發展密切相關， 我們的初步研究結果表明， 干擾FAK基因表達后使Caco2細胞增殖、 遷移力明顯減緩、 細胞出現凋亡等現象， 且FAK基因表達受抑后胞質形態結構受損， 其機制可能與抑制Caco2細胞FAK mRNA和蛋白表達水平有關。因此靶向抑制FAK基因的表達， 可能是結直腸癌治療的有效途徑。此研究為RNAi在腫瘤治療方面奠定了實驗基礎， 也為臨床研究和進一步的治療研發提供了更多的依據。

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第4篇

最近，有關腫瘤發生發展分子機制的研究表明，在惡性腫瘤細胞中，細胞內的各種基本過程是調節失控。這些過程包括：細胞周期的調控，信號傳遞通路的阻斷，細胞凋亡等。研究者將注意力轉向癌的病因學與病理過程中起作用的特異的分子及生物靶點。如細胞凋亡誘導劑、信號傳導阻滯劑、血管生成抑制劑、化療與放療保護劑的尋找。

1 細胞凋亡誘導劑

細胞凋亡是在基因調控下發生的細胞自殺行為。細胞在各種因素如DNA損傷藥物、生長因子撤出等作用下，Bcl-2、p53、C-myc、p21等細胞凋亡調控基因的表達發生改變，同時引起一系列生化變化，如胞內Ca2+水平升高，pH值下降，某些蛋白酶活性增高，最終發生細胞凋亡，已有越來越多的證據表明細胞凋亡與腫瘤的發生、發展、治療及預后密切相關。

Bcl-2的過度表達使腫瘤細胞對一系列細胞毒化療藥物耐受性增加，p53缺失的小鼠對DNA損傷性藥物同樣表現高度抗性。因此，可以制定一種聯合化療的策略，一種藥物抑制細胞凋亡抑制蛋白(Bcl-2，Bcr-Abl)，降低Bcr-abl的表達，使Bcl-2失活，干擾其與Bax的結合，恢復p53功能；另一種細胞毒藥物，以遠低于通常所用的劑量直接殺傷腫瘤細胞，已得到實驗證明是可行的。細胞內Ca2+升高在多種藥物誘導的細胞凋亡中有重要作用，因此人為地調節細胞內Ca2+濃度，提高腫瘤細胞對凋亡誘導劑的敏感性，也是一種有效的治療方法。這一療法將為治療非雄激素依賴的前列腺癌展示了美好前景。

2 信號傳導阻滯劑

目前，研究腫瘤細胞信號傳導機制，選擇性阻斷腫瘤細胞自分泌或旁分泌的信號傳導通路，破壞其自控性生長調節機制，正在成為極具吸引力的研究熱點。一方面可以通過阻斷生長促進因子或增強生長抑制因子的作用，使腫瘤細胞的生長減慢或停止，另一方面也可以通過促進腫瘤細胞的分化，恢復其正常的生長調節機制而改變其惡性表型。這兩方面的作用均可通過選擇性地調變腫瘤細胞信號傳導系統的不同組分而達到。這與經典的細胞毒性抗癌藥物相比，具有選擇性強、毒副作用小、不受細胞產生抗藥性的影響等優點，尤其對晚期腫瘤或轉移癌可能具有獨到的療效，很有希望成為新一代抗癌藥物。因此研究腫瘤細胞信號傳導機制具有潛在的應用價值和意義。細胞信號傳導藥物的作用方式可根據不同情況選擇：

2．1 多數情況下，正常的細胞信號傳導機制在腫瘤細胞中過度活躍，或正常信號分子過度表達。此時可通過部分阻斷過度激活的細胞信號傳導途徑，或抑制過度表達的信號分子的方法，使腫瘤細胞生長速度減慢，直至接近正常細胞水平。

2．2 在某些情況下，腫瘤細胞中的信號分子選擇性激活，使得細胞信號傳導發生異常。可以利用這個特點，選擇性地調變腫瘤細胞中的PKC亞型。許多腫瘤中可見不同的酪氨酸激酶受體的過度表達或過度激活，如上皮細胞腫瘤中常見EGFR家族受體的過度表達，血液細胞腫瘤中常見IGFR家族受體的過度表達，膠質瘤中常見PDGFR家族受體的過度表達等。因此，阻斷酪氨酸激酶受體信號轉導將抑制腫瘤的生長。

細胞信號傳導抑制劑幾乎是與基因治療同步進入腫瘤臨床治療實驗的。腫瘤細胞信號傳導藥物將是抗癌藥物研究的一個重要方向。

3 血管生成抑制劑

從癌前病變到侵襲，癌發展階段伴隨著血管生成。目前已經闡明新生血管形成的機制，無疑為抗腫瘤藥的發現提供了新的靶點，現已明確至少有12種血管生成促進劑和抑制劑，包括：血管內皮生長因子、FGF、血管生成劑等。這些因子在許多人、鼠腫瘤及正常組織中均有表達；同時，在腫瘤及正常組織中抗血管生成因子也有表達，這表明血管生成的調控有賴于正、負信號的相對平衡，這種平衡的失調便導致新的血管生成。

許多血管生成抑制劑已進入臨床試驗，包括TNP-470， Marimastat，干擾素(INF)α2a等。其中INFα-2a為第一個應用于臨床，用以治療晚期兒童血管瘤，第二代更為有效的內源性血管生成抑制劑，如Endostatin和可溶性VEGF受體均已進入臨床試驗。這些效果很好的血管生成抑制劑均需長期服藥才能在動物模型上抑制血管生成以引起腫瘤減退，臨床療效有待證實。但無論如何，血管生成抑制劑是抗癌藥物研究領域一個頗有前景的發展方向。

4 化療與放療保護劑

最新的研究進展表明，p53基因與腫瘤化療和放療所引起的副作用有著密切的關系。自1989年以來，人們在越來越多的不同類型的腫瘤中發現了p53基因的突變，其頻率可達50-60%，突變的形式可表現為點突變、缺失突變、插入突變、移碼突變、基因重排等。存在p53突變的腫瘤包括胃癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、膠質細胞瘤、軟組織肉瘤等大多數實體瘤。目前臨床上常用的抗腫瘤藥如紫杉醇、阿糖胞苷等以及放療所采用的UV射線、g射線等均被認為是通過誘導p53基因依賴性的細胞凋亡而發揮抗腫瘤作用。新近研究表明，在小鼠的一些正常組織如淋巴組織、造血器官、腸上皮、等均有p53高表達，而這些組織也正是許多抗腫瘤藥物易損傷的部位，也即多數抗腫瘤藥產生副作用的敏感器官，如白細胞減少、血小板減少、造血功能降低、胃腸道反應等等。

5 藥物基因組學

第5篇

【關鍵詞】 治療性克隆；細胞核;移植；胚胎干細胞

1治療性克隆概述

治療性克隆（therapeutic cloning）是體細胞核移植技術和最新的人胚胎干細胞技術結合的產物，將成為人類醫療歷史上革命性的技術. 該技術首先應用患者體細胞，如皮膚細胞、骨髓間充質干細胞，作為核供體，移植入去核的人卵母細胞，獲得克隆胚胎；然后從克隆胚胎分離建立胚胎干細胞系；并將這些胚胎干細胞在一定條件下，誘導分化成所需要的各種類型的細胞用于治療目的［1，2］. 目前已報道，將產生多巴胺的神經元細胞用于治療帕金森癥［3］，將產生胰島素的胰島細胞治療糖尿病患者［4］. 從理論上來說由于使用的是患者自身的細胞生產出來的治療用細胞，移植這些細胞到患者體內將不會產生免疫排斥反應. 另一方面，每年都有數以百萬計的患者需要細胞、組織的修復或者器官移植，由于胚胎干細胞可以無限傳代，在數量上可以保證治療的需要，從而解決可供移植的細胞、組織和器官來源嚴重不足的瓶頸問題［5］，為人類健康和長壽提供了新的希望.

近年來，利用核移植技術和胚胎干細胞技術相繼建立了人核移植胚胎干（nuclear transfer embryonic stem cell，ntES）細胞系和人兔異種間ntES細胞. 這2項階段性研究成果的取得，標志著治療性克隆研究的巨大進步. 韓國科學家Hwang等［6］通過核移植技術獲得了人人ntES細胞. 他們以健康女性志愿者的體細胞為核供體，以其自身卵母細胞為受體. 在30枚核移植囊胚中，得到20個內細胞團（ICMs），建成1株人 ntES細胞系，可傳代培養70 代以上. 上海第二醫科大學盛惠珍研究小組［7］在國際上首次構建了人兔核移植重構胚. 分別將5，42，52和60歲4個年齡組的人皮膚成纖維細胞核移入去核兔卵母細胞內，獲得ntES細胞，通過原位雜交、免疫組化、核型和同源基因分析等證實 ntES細胞具有人源性，并且保持干細胞的未分化特性，能形成類胚體，在一定誘導條件下可以分化為神經、肌肉等3個胚層的細胞群. 200506，漢城國立大學的研究者［8］以患者的皮膚細胞為供體，以志愿者捐贈的卵母細胞為受體，利用體細胞核移植技術成功建立11株人核移植胚胎干細胞，這些細胞具有多能性，染色體正常，與供核患者的DNA一致、組織相容性抗原一致.

2治療性克隆的應用前景

ES細胞在生物醫學的各個領域均有廣闊的應用前景，ntES細胞也有著同樣廣闊的前景，為臨床治療學、細胞生物學、生物發育學、比較動物學等研究提供研究材料和方法.

2.1臨床疾病的治療ntES細胞與普通的細胞移植治療相比，具有革命性的進步. 它以患者的體細胞為核供體，通過核移植技術獲得的ntES細胞，與患者的遺傳物質相同，可以消除受體對供體的免疫排斥反應，為目前多種退形性疾病，如心臟病、脊髓損傷、帕金森病、1型糖尿病等的治療帶來了新的希望. 特別是一些目前還沒有找出致病基因的遺傳病，如脊髓側索硬化癥，ntES細胞移植是最有希望的治療方法. 目前已經應用ntES細胞在體內外分化成多種細胞，包括神經細胞和生殖細胞［9，10］. 尤其Barberi等［9］建立了一套方法，能使 ntES細胞向中樞神經系統細胞特定分化，能產生高效率的神經膠質細胞、寡突細胞、神經元細胞，包括多巴胺能神經元、γ氨基丁酸能神經元等，將分化的多巴胺能神經元移植到 Parkinson病模型后，能改善其癥狀. 細胞治療的途徑有兩種：其一，ntES細胞定向分化后移植. 細胞擴增后，體外定向分化，對分化細胞進行純化，將獲得的目的細胞移植到病變部位，替代喪失功能的部分細胞；其二，ntES細胞原位移植. 與定向分化后相比，ntES細胞原位移植有以下缺點：①沒有經過純化，可能將污染的異源飼養層細胞帶進移植部位；②ntES細胞沒有轉入經選擇基因，無法控制植入細胞的命運，可能發生癌變；③ntES細胞分化成分復雜，目的細胞分化成分少，可能出現大量非必須細胞的分化.

2.2細胞生物學通過研究ntES細胞的體外分化特性，可以識別某些靶基因，對人類新基因的發現，功能基因的研究，以及基因治療的研究均有重要意義. 通過探討ntES細胞體外增殖和分化的機制，了解各種生長和分化因子的作用，為組織再生和修復的研究提供了新的工具；通過誘導ntES細胞癌變，可分析腫瘤細胞發生的分子機制. ntES細胞作為一種得天獨厚的研究材料，對于闡明細胞增殖、分化、凋亡、遷徙、惡變等機制有著重要意義. 自發現ES細胞以來，人們已經利用ES細胞建立了多種細胞類型的體外分化系統，體外分化的多種細胞類型都曾被成功的植入胎鼠或成體鼠，在受體鼠體內形成有功能的細胞群.

2.3發育生物學由于哺乳動物在母體內受胚胎發育的個體大小和內環境條件的限制，很難系統地研究其早期的發育進展、細胞分化及調控機制等. 比較動物卵母細胞質對同種或異種細胞核發育的影響，在細胞和分子水平上為研究哺乳動物胚胎早期發育的調控機制提供了良好的材料和方法，也為研究胚胎發育的影響因素提供了便利條件. 建立在ES細胞和基因打靶技術基礎上的復雜的轉基因系，使人們可以建立有效的分析系統，從而在分子水平上研究不同的生物學問題. 它不僅可以將一些在發育過程中對動物體非必需或可被替代的特定基因進行敲除(gene knockout)，在體內進行功能缺失研究，而且還可以研究基因在不同發育時期中的作用. ntES細胞作為一種體外細胞系，提供了一個研究處理整體細胞群的實驗體系. 因此，就有可能人為地產生一些基因突變，如對胚胎致死性基因的研究等，也可利用這些突變的基因來克隆產生轉基因小鼠，從而建立基因突變的模型.

3治療性克隆面臨的問題

3.1亟待解決的問題①體細胞克隆效率與ntES細胞建系效率普遍較低：核移植胚發育至囊胚的幾率為19%～25％，與牛、豬的核移植囊胚發育率相當分別約為25％和26％；從克隆囊胚獲得ntES細胞的效率僅有4%~16％，平均8.2%［11］. ②卵母細胞來源問題：ntES細胞用于人治療性克隆，卵母細胞的需求量是非常大的，目前盡管已有許多措施來改進核移植技術，但仍沒有明顯提高. 要得到一個ntES細胞系平均需要12 個囊胚，而所需要的卵母細胞數就更多了，一個ntES細胞系平均需要666個. 如果ntES細胞系用于人類疾病的治療，這樣的代價是非常大的，即使目前報道的最高效率的建系，也是30個卵母細胞，才能得到一個ntES細胞系. 另外一種替代策略就是利用非靈長類異種哺乳動物的卵母細胞，例如兔、山羊等. ③倫理問題：胚胎生物技術涉及使用早期未著床的胚胎，特別是治療性克隆技術還將無法避免的使用通過體細胞克隆獲得的人的早期克隆胚胎. 世界各國尤其是西方國家對此爭論很大［12，13］. 迫于社會公眾與宗教的壓力，大多數西方國家對治療性克隆技術應用于人類，持反對態度，不允許國家科研經費支持治療性克隆的研究. ④臨床應用問題：如ES細胞系可能在培養過程中出現染色體非整倍性問題，ES細胞定向分化能力及分化細胞的穩定性問題；其次，異種核移植產生的人動物重構胚還存在安全性問題：異種重構胚在發育早期含有2種線粒體，以后供核體的線粒體取代了受體的線粒體，但受體卵漿中所帶的異種蛋白，包括細胞器及mRNA，它們的命運如何，是否也像線粒體一樣完全被供核體所取代，還有待進一步證明. 再次，在核移植的過程中，可能存在跨種間病毒傳染，例如，人兔核移植胚胎干細胞，有可能將某些目前未知的兔疾病傳染給人類，就像艾滋病病毒可能是從非洲猩猩而來那樣.

轉貼于

3.2建立我國知識產權的治療性克隆技術隨著干細胞技術和體細胞核移植技術的研究進展，我國學者在治療性克隆的技術方面也處于世界前列. 當前，在我國研究和發展治療性克隆技術，建立我國知識產權的治療性克隆的細胞產品，創建細胞治療產業，是一個很好的機遇. 我國在治療性克隆研究領域的優勢：①目前，我國在哺乳動物克隆技術的研究方面處于國際先進水平，相繼成功克隆出了牛、羊等動物. 1991年，西北農林科技大學生物工程研究所在世界上首次獲得山羊胚胎細胞核移植成功，共得到5只羔羊. 1998年，該研究小組用來自成年雌性山羊的皮膚成纖維細胞作供體，采用細胞質內直接注射的方法將供體細胞核直接注入去核卵母細胞內，胚胎激活后移植到受體母羊子宮角，獲得了2只體細胞核移植后代，這是世界上首批成年體細胞克隆山羊，并獲得了克隆山羊的第4代后裔，目前仍生長健康. ②寬松的人文環境. 中國公眾有著不同于西方的倫理觀念，對于動物權利和早期胚胎的擔心沒有西方國家嚴重，也基本沒有因為宗教信仰而反對胚胎生物技術的問題. ③法律和法規的基本保證. 為保證和促進人胚胎干細胞研究的健康發展，國家科技部和衛生部聯合下發了《人胚胎干細胞研究的倫理指導原則》，使治療性克隆的研究合法化. 但我國明令禁止克隆人和買賣人類胚胎.

然而，中國的優勢不能在治療性克隆的研究領域走在國際前列，主要原因是經費不足和相關學者缺乏協同研究. 應用克隆技術結合胚胎干細胞體外誘導分化和細胞治療方法的關鍵是技術問題. 我們希望臨床學者與基礎細胞生物學家聯手合作，借鑒國外的思路，應用自愿者的卵母細胞，建立中國人的ntES培養技術，為治療性克隆的臨床應用奠定基礎. 我們堅信，中國有可能在這個領域走在世界前沿.

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第6篇

【摘要】 為了觀察了解兒童急性白血病細胞中轉錄因子PAX5的表達特性，采用實時定量RT-PCR方法測定了6個血液腫瘤細胞株以及6例正常兒童、58例初發和4例復發急性白血病兒童（其中包括39例B-ALL，10例T-ALL和13例AML）骨髓細胞中PAX5和CD19 mRNA的表達水平。結果表明：在Namalwa（B細胞系）細胞株中，PAX5和CD19 mRNA相對表達量分別為2.35%和2.52%；而在T-和髓系細胞株中幾乎不表達。在臨床樣本中B-ALL組比T-ALL組和AML組的PAX5 mRNA表達高（P=0.029和P=0.013）。T-ALL組和AML組的PAX5 mRNA表達水平均低于正常對照組，而T-ALL組與AML組之間的表達差異無顯著意義。在B-ALL患兒中，PAX5 mRNA表達的個體差異很大。此外還發現，初發治療前組和復發組的B-ALL患兒PAX5 mRNA表達高于化療完全緩解組（P=0.011和P=0.006）。由于在CD19基因的啟動子上有B細胞特異性激活蛋白的結合位點，研究發現在B-ALL中PAX5表達水平與同樣用實時定量RT-PCR檢測的CD19表達水平之間存在明顯的相關性。結論：運用實時定量RT-PCR方法能快速準確地在B-ALL的臨床標本中檢測和定量PAX5基因的表達。研究中發現部分B-ALL中PAX5 mRNA表達明顯升高，因此它可將其作為進一步研究B-ALL發病機理的另一個切入點。

【關鍵詞】 轉錄因子

Expression of the Transcription Factor PAX5 in Childhood Acute Leukemic Cells

Abstract

To investigate transcription factor PAX5 expression characteristics in childhood acute leukemic cells，expression levels of PAX5 and CD19 mRNA in 6 hematological tumor cell lines and bone marrow cells of 6 normal children，58 de novo patients and 4 relapse acute leukemic children，including 39 cases of B-ALL，10 cases of T-ALL and 13 cases of AML，were detected by a real-time RT-PCR. The results showed that PAX5 and CD19 mRNA expression levels were 2.35% and 2.52% in Namalwa (B-cell lines) respectively，but almost not detectable in other T- and myeloid cell lines. Among clinical samples，expression of PAX5 mRNA in B-ALL was significantly higher than that in T-ALL and AML(P=0.029 and P=0.013 respectively). PAX5 expression was significantly lower in T-ALL and AML than that in normal controls.The difference of PAX5 mRNA expression levels between T-ALL and AML was not significant. Inpidual difference of PAX5 mRNA expression levels in children with B-ALL was great. Moreover，PAX5 mRNA expressions in de novo

and relapse patients with B-ALL were significantly higher than those in remission (P=0011 and P=0.006 respectively). As binding sites for B-cell specific activator protein have been identified in the promoter regions of CD19，the study found that in B-ALL，there was clear correlation between the expression levels of PAX5 and CD19，which was also studied by real-time RT-PCR. It is concluded that PAX5 transcripts are readily detectable and quantifiable in clinical materials with B-ALL by real-time RT-PCR. The strong PAX5 mRNA expression in some B-ALL can be considered to be particularly interesting for further analysis.

Key words transcription factor；PAX5；CD19；acute leukemic cell；real-time RT-PCR

PAX5基因是成對區PAX基因家族的成員，它編碼的核反式作用因子——B細胞特異性激活蛋白（B-cell specific activator protein，BSAP）在發育的中樞神經系統、成人和B淋巴細胞中表達［1］。在B細胞發育過程中，PAX5基因的轉錄起始于Pro-B（Pre-B1）期，表達于Pre-B和成熟B細胞中，但在漿細胞中不表達［1，2］。BSAP通過與多種B細胞特異性基因（如CD19，VpreB，RAG2，mb-1）啟動子或增強子上的BSAP結合位點結合，對這些基因的表達起著調控作用，因而BSAP在B細胞定向分化、發育、增殖、同型轉換、免疫球蛋白分泌和終末分化階段中發揮了重要的作用［1］。近年來研究表明，PAX5基因在成神經管細胞瘤、成人惡性膠質瘤、淋巴瘤和人膀胱移行細胞癌中表達失調，并且與惡性分化程度相關［3］。在血液腫瘤中，以往有關PAX5的研究主要局限于在淋巴瘤中的改變［4-6］。有關PAX5在急性白血病（尤其是急性B淋巴細胞性白血病）中較為詳盡的研究迄今為止文獻報道很少［5，6］。本研究在mRNA水平運用實時定量RT-PCR檢測血液腫瘤細胞株、兒童急性白血病細胞及正常兒童骨髓細胞中PAX5 mRNA的表達水平，從中了解PAX5在兒童急性白血病中的表達特性，為進一步明確其在急性白血病發生中的作用機制奠定基礎，同時也為利用PAX5基因表達產物作為潛在腫瘤標志和基因治療靶位的應用方面提供依據。

材料和方法

血液腫瘤細胞株及培養

6個血液腫瘤細胞株：Namalwa、SUP-M2、K-562、NB4、HL-60、Jurkat用含2 mmol/L谷氨酰胺和10%胎牛血清的RPMI 1640培養液在37℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養。

臨床病例來源

2003年2月至2004年2月新華醫院、上海兒童醫學中心收治的初發和復發兒童急性白血病患者62例，其中初發病例58例，復發病例4例；男45例，女17例；年齡4個月-15歲，中位年齡6歲。所有患兒均采用MIC（即細胞形態學、免疫表型、細胞遺傳學及相關的分子生物學）分型診斷。按FAB分型，ALL 49例（包括L1 15例，L2 21例，L3 7例，未分亞型者6例）；AML 13例（包括M1 1例，M2a 3例，M2b 1例，M3 2例，M4 2例，M5 3例，M7 1例）。在ALL中，按免疫表型可分為T系-ALL 10例和B系-ALL 39例；39例B系-ALL（CD19+）還可進一步分成4個亞型，分別是： Pro B（CD10-/cytoplasmic μ〖cμ］-）1例，CALL（即Common-B-ALL，CD10+/cμ-）26例，Pre B（CD10+ or -/cμ+）11例和B Cell（即mature-B-Cell，SIg+）1例。另收集13例B系-ALL患兒誘導緩解治療結束時微小殘留病（MRD）監測

采集上述正常對照兒童及白血病患兒的骨髓或外周血標本2-3 ml（肝素抗凝），用淋巴細胞分離液室溫300×g離心30分鐘，分離單個核細胞，再用PBS洗滌2次，取約5×106個細胞加TRIZOL試劑1 ml，混勻后，-80℃保存，待提取RNA之用。初發和復發病例標本中白血病細胞的百分比>80%，必要時B系-ALL標本可通過CD19單克隆抗體免疫磁珠分選法富集白血病細胞（參見Immunotech公司免疫磁珠分選說明書）。

RNA提取和cDNA合成

總RNA提取參照TRIZOL試劑說明書。用紫外分光光度計測RNA濃度（RNA 濃度=A260×40 μg/ml×1/光徑×稀釋倍數）及純度（A260/A280比值在1.8-2.0），再用2%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質量，而后RNA可儲存于-80℃備用。cDNA的合成根據TaqMan反轉錄試劑盒說明，把0.2 μg總RNA反轉錄成為單鏈cDNA。反應體系10 μl，包括10×TaqMan RT緩沖液1 μl，25 mmol/L MgCl2 2.2 μl，dNTPs mixture（2.5 mmol/L each dNTP）2.0 μl，50 μmol/L隨機引物0.5 μl，RNase抑制劑（20 U/μl）0.2 μl，MultiScribe逆轉錄酶（50 U/μl） 0.25 μl，以及已溶解在3.85 μl無RNase水中的0.2 μg RNA。上述混合物孵育在25℃ 10分鐘，48℃ 30分鐘和95℃ 5分鐘。所獲得的cDNA可儲存于-20℃備用。

實時PCR

實時定量PCR運用TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒在ABI Prism 7000實時熒光定量PCR儀上檢測。PAX5、CD19和GAPDH的引物和探針采用TaqMan Assays-on-Demand基因表達產品，其MGB探針以FAM染料作為熒光標記。實時PCR反應體積25 μl各含TaqMan Universal PCR Master Mix（2×）12.5 μl，20×Assay-on-Demand Gene Expression Assay Mix 1.25 μl以及25 ng cDNA模板。PCR反應條件為：預熱50℃ 2 分鐘（激活uracil-N-glycosylase），95℃ 10分鐘（滅活UNG酶，同時激活AmpliTaq Gold DNA Polymerase），緊接著40個循環的95℃ 15秒（變性）和60℃ 1分鐘（退火和延伸）。本研究同時把Namalwa細胞株RNA反轉錄成的cDNA進行系列稀釋作為實時PCR擴增模板進行PCR擴增，以證明靶基因PAX5、CD19和內源控制物GAPDH的擴增效率基本相同。由于所有的PCR反應具有基本一致的擴增效率，因此就可以用比較Ct法的相對定量策略，即每個樣本PAX5、CD19的相對mRNA表達水平能直接用樣本各自的內源控制物GAPDH表達來標準化加入的初始RNA量。簡單地說，每個樣本中靶基因PAX5、CD19的相對mRNA表達水平可以用以下公式計算：相對mRNA表達=2-Ct×100%，式中Ct值=靶基因Ct值-GAPDH Ct值。

統計學處理

用SAS 6.12統計軟件包和Sigma Plot 2001，Version 7.101軟件處理數據并繪制統計圖，PAX5 mRNA相對表達量用x±SD（%）表示，采用t檢驗和線性相關與回歸進行分析。P≤0.05被認為有統計學意義（雙側檢驗）。

結 果

血液腫瘤細胞株的PAX5和CD19 mRNA表達

本研究運用實時RT-PCR比較Ct相對定量法，檢測了6個血液腫瘤細胞株中PAX5和CD19的mRNA表達，發現人成熟B細胞性淋巴瘤細胞株Namalwa的PAX5和CD19 mRNA相對表達量分別為2.35%和2.52%；而T細胞株（SUP-M2和Jurkat）的PAX5 mRNA表達極微量，分別為0.0033%和0.0018%，且未檢測到其相應的CD19 mRNA表達；髓系細胞株（K-562、NB4和HL-60）PAX5 mRNA表達均為陰性。

急性白血病兒童與正常對照兒童的PAX5 mRNA表達

本研究運用實時RT-PCR檢測了臨床初診和復發的39例B-ALL、10例T-ALL和13例AML骨髓白血病細胞PAX5 mRNA的相對表達量，同時也檢測了6例非血液系統疾病兒童骨髓和8例健康兒童外周血單個核細胞PAX5 mRNA的相對表達量作正常對照。圖1顯示了上述不同類型的急性白血病和正常對照中PAX5 mRNA相對表達量的分布，從中可見B-ALL的PAX5 mRNA相對表達量范圍變化很大，從（0.12-61.13）%不等。表1列出了急性白血病兒童與正常對照兒童平均PAX5 mRNA表達量的比較。統計表明： B-ALL組的平均PAX5 mRNA表達量比T-ALL組和AML組高（P0.05）。T-ALL組與AML組之間的平均PAX5 mRNA表達量差異也無顯著意義（P>0.05），但其分別與正常對照BM和PB組的平均表達量差異有非常顯著意義（P

B-ALL兒童的PAX5 mRNA表達

初發和復發B-ALL患兒骨髓白血病細胞的PAX5 mRNA表達范圍變化很大，從0.12%到61.13%，平均表達（9.65±13.21）%，不存在性別差異（男女患兒平均表達分別為（8.53±12.13）%、（13.41±16.58）%，P=0.337）。本研究僅檢測了1例10歲患兒的平均PAX5 mRNA表達為（5.22±6.34）%，兩組之間差異無顯著意義（P=0.284）。按照FAB分型，L1、L2和L3 3組之間的PAX5 mRNA表達經兩兩比較差異均無顯著性意義（P>0.05）。

比較不同化療階段B-ALL患兒PAX5 mRNA表達發現：初診化療前組患兒與復發組患兒的平均PAX5 mRNA表達差異無顯著意義（P>0.05），而化療緩解（MRD

本研究在運用實時RT-PCR檢測臨床病例和正常對照的樣本中PAX5 mRNA相對表達量的同時，還檢測了樣本中CD19 mRNA相對表達量。通過統計分析39例B-ALL樣本中PAX5 mRNA與CD19 mRNA相對表達量之間的關系發現：在mRNA水平上PAX5的表達與CD19的表達之間存在明顯的相關關系（r=0.516，P=0.0008）（圖2）。

討 論

兒童急性白血病（以急性B淋巴細胞性白血病為主）是嚴重危害兒童生命的惡性腫瘤。隨著醫學科學的進步，當前以化療為主要手段的綜合治療已使大多數急性白血病患兒經治療后可獲得緩解，但最終仍有部分患兒復發。對于白血病的確切發病機制目前尚不清楚，因此從細胞發育、增殖、分化等方面多角度深入研究兒童急性白血病發生發展中的表達特性，從中逐步明確其發生機理，將為白血病的治療提供新的思路并將提高白血病的治愈率及長期無病生存率。

在淋巴造血系統中，PAX5/BSAP被認為是B細胞特異性的標志。目前臨床上對于PAX5/BSAP的研究主要集中于運用免疫組織化學檢測正常淋巴組織細胞和血液腫瘤（主要是淋巴瘤）組織細胞中BSAP的表達［4-6］。Krenacs等［4］和Torlakovic等［5］對較大數量的多種亞型淋巴組織標本中BSAP表達的研究顯示，BSAP僅表達于正常和腫瘤的B細胞中，且在不同的B細胞亞類和B細胞非何杰金氏淋巴瘤亞型中PAX5表達的水平各不相同，而在T細胞和T細胞性淋巴瘤細胞中表達為陰性。然而新近同樣的研究，Zhang等［6］的報告卻顯示PAX5在1個T細胞性淋巴瘤細胞中表達，并且在T-ALL和AML中也有50%表達PAX5。此外，Hamada等［7］報道，運用RT-PCR能快速地在不同種類B細胞性腫瘤的臨床標本中檢測到PAX5轉錄。

本研究首先運用了實時RT-PCR比較Ct法的定量策略來檢測血液腫瘤細胞株中PAX5和CD19的mRNA相對表達量，在6個血液腫瘤細胞株中Namalwa（B細胞系）的PAX5和CD19 mRNA相對表達量分別為2.35%和2.52%，而T系和髓系細胞株幾乎不表達，這與Hamada等［7］的研究結果相近。

本研究還運用實時RT-PCR來測定臨床初診和復發的兒童急性白血病骨髓細胞中PAX5 mRNA的表達，并以正常BM和PB的單個核細胞作對照。研究發現：在不同白血病和正常對照中平均PAX5 mRNA表達高低依次順序為B-ALL組>Normal BM組>Normal PB組>T-ALL組>AML組。由此可見，在兒童急性白血病中，PAX5主要在B-ALL中表達，而T-ALL和AML中表達均極低；研究中發現部分B-ALL中PAX5 mRNA表達明顯升高，因此可將其作為進一步研究B-ALL發病機理的另一個切入點。

此外，不同化療階段B-ALL的PAX5 mRNA表達的分析發現：初診化療前組和復發組的平均PAX5 mRNA表達比化療緩解組的表達高。因此，對于ALL兒童最好應在初診化療前即測定PAX5 mRNA表達，其后作動態觀察，這樣可以評估治療反應，利于及時調整化療方案。

在許多B細胞特異性基因的啟動子上目前已發現多種BSAP的結合位點［8］，其中包括CD19基因啟動子上的BSAP結合位點［9］，通過此位點BSAP對CD19表達起調節作用。CD19是B細胞表面信號傳導系統的一個主要成分，它的活化啟動多種細胞內信號傳導途徑［10］。本研究在用實時RT-PCR研究B-ALL中PAX5 mRNA表達的同時，也檢測了相應的CD19 mRNA表達，經統計分析兩者之間的表達存在明顯的相關性，與此前的有關研究報道［6，7］不甚一致，其可能的原因是： ①研究對象不同，此前的報道主要是淋巴瘤，且研究標本量少；本研究對象則為B-ALL，標本量相對較多；②研究方法不同，此前的報道運用的是Northern blot，傳統PCR和流式細胞術；本研究運用實時RT-PCR。鑒于在B-ALL中PAX5與CD19 mRNA表達之間存在的明顯相關性，可以認為，在B-ALL中PAX5通過調控其目標基因CD19表達來影響細胞內多種信號傳導途徑，進一步可能影響腫瘤的發展。

由于目前未見有關詳細研究白血病中PAX5 mRNA表達特性的文獻報道，因此沒有與本研究結果可以相比較的相關資料可資參照分析。也就是說，本研究可能是首次較為詳盡地報道運用實時RT-PCR評估急性白血病細胞中PAX5 mRNA的表達。至于在B-ALL中PAX5表達的更加確切的規律和作用，還有待于對更多臨床樣本進行較為長期的觀察研究。

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第7篇

【關鍵詞】 胃腫瘤；抑癌基因；Runx3

Runx3（PEBP2αC/CBF A3/AML2）基因是一個腫瘤抑制基因，其功能缺失與多種惡性腫瘤的發生發展有關。自2002年日本學者Li等［1］首先報道Runx3有調節胃上皮細胞的增生與凋亡平衡的作用以來，Runx3與胃癌發生、發展的相關研究已成為胃癌研究領域的熱點。現對Runx3與胃癌的研究現狀做一綜述。

1 Runx3基因、蛋白結構及其功能

Runx3來自Runt結構域轉錄因子（Runt domain transcription factors），是轉錄因子Runx家族成員之一，Runt區域轉錄因子也稱PEBP2/CBF（polyomavirus enhancer-core binding protein 2/core binding factor），是TGF-β超家族信號重要的靶目標，在哺乳動物生長過程中扮演重要角色。該基因家族在哺乳動物有3個成員Runx1、Runx2、Runx3，它們的產物都是由α和β亞單位構成的異二聚體［2］，具有不同生物學功能，Runx1與造血功能有關，Runx2是重要的骨生成調節因子，Runx3對脊神經節的神經發育及胃黏膜上皮細胞的增生調控和T細胞的分化起重要作用［1，3］。

Runx3（Runt related transcription factor 3 gene）基因位于人染色體的1p36.1，基因全長約67 kb，含有P1和P2 兩個啟動子，6個外顯子和1 290 bp的開放閱讀框，內含子1跨越了整條基因全長的一半（35kb）。兩個啟動子區域均含數個分離的轉錄起始點，其中Runx3 mRNA主要來自于P2啟動子的轉錄［3］。兩個啟動子的GC含量不同，P2啟動子GC含量高（64％）。在外顯子2 相當于啟動子P2 的位置和外顯子6 的起始部位有兩個大CpG島［4］。

人類Runx3蛋白是α、β兩個亞單位構成的異二聚體，包含415個氨基酸殘基，α亞單位含有一個 RD（Runt domain）保守域，RD位于Runx蛋白的氨基酸末端，由128個氨基酸組成，介導Runx蛋白與DNA結合以及蛋白質之間的相互作用［5，6］。α亞單位介導RD與靶DNA結合，β亞單能增強RD與靶DNA的結合力［7］。

Runx蛋白的羧基端富含脯氨酸和絲氨酸，對基因的轉錄調控起重要作用［2，7］。

2 Runx3與胃癌的相關研究及其抑癌機制

2.1 Runx3與胃黏膜的關系 Li等［1］研究發現敲除Runx3（Runx3-/-）的小鼠胃黏膜明顯增厚，Runx3-/-小鼠培養細胞對TGF-β誘導的生長抑制和凋亡作用不敏感，且Runx3-/-小鼠胃組織中半胱天冬酶3（caspase3）無活性［1］。Fukamachi等［8］研究發現Runx3 缺失時胃黏膜細胞處于低分化狀態。這些觀察表明Runx3是胃黏膜上皮主要生長調控因子，是胃上皮細胞中重要的致凋亡因素。

2.2 胃癌中Runx3表達情況 研究發現，胃癌中Runx3的表達明顯下調或缺失。Li等［1］應用RT-PCR、Southern blot和原位雜交方法對15株胃癌細胞系和46例胃癌組織標本的Runx3 mRNA表達進行檢測，結果發現47%的胃癌細胞系中Runx3無或低表達;60.9%的胃癌組織中Runx3無表達或低表達，Runx3的表達率與胃癌臨床分期呈負相關。所以認為Runx3 基因與胃癌的發生、發展有著極其密切的關系，并且隨著胃癌分期的增高表達進一步降低。Osaki等［9］應用Western印跡法分析了6株胃癌細胞系Runx3蛋白質的表達情況，結果50%的細胞系Runx3表達陽性，與Li等報道的結果基本一致;此外，還通過免疫組化法揭示83例正常胃黏膜組織均有Runx3表達，而對應的腸上皮化生組織和癌組織中均無Runx3 表達［9］。

2.3 Runx3與胃癌的相關性 Li等［1］報道Runx3-/-、p53-/-小鼠胃黏膜培養細胞能建立裸鼠種植腫瘤（腺癌），而Runx3+/+、p53-/-小鼠胃黏膜上皮培養細胞則不能，這表明Runx3功能缺失可能誘導了胃癌的發生。Guo等［10］以胃癌細胞系（Runx3-/-）作為感受態細胞，將外源性Runx3基因分別轉染克隆體，結果顯示，Runx3高表達克隆組細胞生長抑制最明顯，Runx3低表達組次之，說明Runx3的表達量與胃癌細胞的生長曲線成負相關。Sakakura等［11］研究發現胃癌原發灶和腹膜轉移灶Runx3 mRNA表達較正常胃黏膜明顯下調，尤以腹膜轉移灶下降程度最著。將轉染外源性Runx3的胃癌細胞系注入裸鼠腹腔，結果轉染組腹腔內極少有種植結節，而無轉染對照組動物腹腔內有大量的、明顯的種植結節形成。因此認為Runx3基因的失表達與胃癌的腹膜轉移發生有關。Wei等［12］揭示胃癌組織中Runx3表達水平與患者的生存期密切相關。Peng 等［13］通過對120例胃癌組織中Runx3表達與血管內皮生長因子（VEGF）表達的相關分析，揭示Runx3的轉錄可能與胃癌組織中VEGF的表達下調有關。因此Runx3基因沉默可能會加速胃癌的生長和遠處轉移。

2.4 Runx3抑癌機制 Runt區域轉錄因子與TGF-β超家族成員共同介導一些重要的生物學效應。TGF-β與其跨膜受體Ⅰ和Ⅱ（TβRⅠ和TβRⅡ）結合，產生受體異四聚體復合物（TβRC），從而發揮細胞內生物效應［14］，此過程中Smad蛋白起重要的作用。TGF-β信號轉導通路的配體、受體和胞內信號轉導分子Smad蛋白共同組成一個抑制腫瘤信號的通路。通路異常即可引起信號紊亂，促進多種腫瘤的發生和發展［15］。Runx3蛋白是TGF-β信號通路下游的一個轉錄因子，Runx蛋白與DNA結合，在TGF-β/BMP（bone morphogenetic protein）信號傳導中起重要作用。只有在Runx蛋白的參與下，Smad復合物才能從細胞質內轉入核內的功能靶點，與Runx蛋白共同轉錄激活靶基因，從而對細胞的分化、周期調控、凋亡和惡性轉化起作用［16］。當Runx基因表達受抑制時，影響TGF-β信號通路的轉導，從而誘導腫瘤的發生。

Chi等［17］研究顯示Runx3是p21基因的下游調控子，p21在細胞生長周期中有重要作用，其通過抑制周期素依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent Kinase，CDK）表達而使細胞周期停滯于G1期。p21啟動子包括5個Runx結合位點，即3個完全匹配的a、b、c位點和2個部分匹配的d、e位點，當Runx結合域突變時，p21啟動子的活性明顯降低，而Runx3和Smad3協同表達時p21啟動子被激活，從而使細胞對TGF-β反應增強。Runx3的抑癌活性與其誘導p21表達的能力相關，p53也是通過調控p21表達活性來調節細胞生長周期，故兩者作用機制類似，但作用的信號通路不同。最近有研究顯示恢復Runx3表達可導致cyclin D表達下調，相反 p27和caspase3、7和8則表達上調。這可能是Runx3誘導凋亡的潛在機制［14］。

因此，Runx3抑癌機制主要通過TGF-β信號通路協同Smad蛋白激活p21調節細胞生長周期，并通過下調cyclin D表達和上調p27和caspase3、7和8的表達而誘導凋亡。

3 胃癌中Runx3基因表達降低或缺失的機制

3.1 Runx3基因突變與表達 基因突變是抑癌基因沉默的主要機制之一，然而文獻報道突變不是Runx3表達下調的主要機制［1，12，18］。

3.2 Runx3基因雜合性缺失與表達 Li等［1］應用熒光原位雜交技術（FISH）對15個胃癌細胞系和46例胃癌組織Runx3DNA倍體進行分析，結果發現20%的胃癌細胞系和30%的胃癌組織中的Runx3為異倍體。并采用RT-PCR方法和原位雜交方法分別對這些發生雜合缺失胃癌細胞系和胃癌組織標本進行Runx3 mRNA表達的檢測，發現除1例胃癌組織可以檢測到Runx3 mRNA表達外，其余均無Runx3 mRNA表達。22例Ⅰ期胃癌中有3例Runx3存在雜合缺失，2例Ⅱ期胃癌沒有發現雜合缺失，14例Ⅲ期胃癌中3例Runx3 存在雜合缺失，8例Ⅳ期胃癌中Runx3全都發生雜合缺失變化，說明Runx3的雜合缺失是胃癌中Runx3失活的原因之一，并且Runx3的雜合缺失和胃癌的分期有關。

3.3 Runx3甲基化是胃癌中Runx3表達下調的主要原因 啟動子異常甲基化在基因表達調控、DNA修復、基因穩定及基因抑制方面起重要作用。Runx3啟動子P2區域有一個典型CpG島，理論上說明DNA甲基化可調控P2的轉錄。

Li等［1］揭示Runx3低表達或失表達都與Runx3啟動子P2區域CpG島過甲基化有關。Guo等［10］用N2甲基2N2亞硝基脲誘導鼠胃癌，從中建立4株胃癌細胞系，結果僅一株細胞系有微量的Runx3 mRNA表達，其他3株細胞系均無Runx3 mRNA表達，這3株Runx3基因沉默細胞系在Runx3啟動子區域亦存在明顯甲基化，所有細胞系經過DNA甲基化轉移酶抑制劑52氮唑22脫氧胞苷（deoxycytidine，AZA）、組蛋白去乙酰酶抑制劑曲古抑菌素（trichostatin，TSA）共同處理后均恢復了Runx3表達。Waki等［19］檢測了10株胃癌細胞系、93例胃癌組織及相應正常胃黏膜組織Runx3 基因啟動子甲基化狀態，結果7株胃癌細胞系、42例胃癌組織和7例正常胃黏膜組織存在甲基化。此外，對19例尸檢的正常胃黏膜組織Runx3甲基化狀態進行檢測，其中3例存在甲基化，但年齡均≥77歲，提示除高齡患者外Runx3甲基化幾乎是癌特異性的。Kim等［20］對75例胃癌和各種胃癌前期病變組織（胃腺瘤77例、慢性胃炎伴腸上皮化生32例和慢性胃炎不伴腸上皮化生99例）Runx3甲基化狀態進行檢測，結果發現在胃癌組織中Runx3甲基化發生率為64%，而在各種胃癌前期病變組織中也存在不同程度的Runx3甲基化，其中胃腺瘤27.3%、慢性胃炎伴腸上皮化生28.1%和慢性胃炎不伴腸上皮化生8.1%。而在有腹膜轉移的胃癌標本100%發現Runx3甲基化［11］。因此認為Runx3甲基化發生隨癌前期病變向癌的方向發展而增加，從原位癌到進展期胃癌Runx3甲基化率隨之升高，說明Runx3甲基化從胃癌的發生到胃癌的發展都有很重要的意義。Homma等［21］發現，大多數胃癌細胞系（90%）、胃癌組織（96%）和配對的正常胃黏膜組織（96%）均存在Runx3基因5′端CpG島的甲基化，而在被視為導致基因沉默的關鍵部位——轉錄起始點附近區域的甲基化發生率較低，分別為40%、53%和11%。因此認為，Runx3 基因高甲基化起初發生在5′端CpG島，進而向轉錄起始點區域擴展，最終導致Runx3 mRNA失表達，Runx3基因CpG島多區域甲基化狀態檢測對胃癌的診斷及風險評估具有重要意義。

4 小結

Runx3作為一個新發現的抑癌基因，在調控細胞生長、發育、凋亡和以細胞的信號傳導及其他生物學效應方面有著重要的轉錄調節作用。其啟動子P2區域CpG島的過甲基化和雜合缺失是Runx3基因沉默的主要機制。Runx3的轉錄失活或表達下調可致胃黏膜上皮細胞的過度增生和分化異常，進而參與胃癌的發生和發展過程。Runx3有望成為一個惡性腫瘤，特別是胃癌發生發展的生物學標記物和腫瘤基因治療的靶點（如Runx3基因的導入、逆轉甲基化治療等），有可能為胃癌等惡性腫瘤的診療提供新的策略和方案。

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第8篇

關于椎間盤源性腰痛的概念

所謂“椎間盤源性腰痛”從廣義來上講，是指與腰椎間盤退變有關的腰痛癥狀，當包括椎間盤內紊亂，椎間盤退行性病以及腰椎不穩。1997年Bridwell確定椎間盤源性下腰痛的概念為［1］：椎間盤內各種疾病(如退變，終板損傷等)刺激椎間盤內疼痛感受器所引起的功能喪失的腰痛，不伴根性癥狀，無神經或節段過度活動的影像學證據。目前這個概念被大多數學者所接受。

椎間盤源性腰痛的發病機制

髓核和纖維環的破裂：椎間盤纖維環破裂是椎間盤源性下腰痛的重要原因，在無神經根機械性壓迫的下腰痛患者中，約40%與椎間盤纖維環破裂有關。Osti等對27例脊柱尸檢標本(平均年齡31.5歲)中的135個腰椎間盤進行分析研究［2］，將纖維環損傷分為外周型、環型和輻射型，髓核則分為正常、中度退變和嚴重退變。對中老年患者，椎間盤纖維環破裂的最常見病理基礎是髓核變性致纖維環應力分布失衡，進而導致后部纖維環破裂，而病變椎間盤內高含量的炎性介質刺激竇椎神經末端的傷害感受器可導致劇烈疼痛。但對于年輕的患者，特別是有劇烈運動史時，外周纖維環的物理損傷可能是導致疼痛的原因之一。

腰椎間盤的神經分布及發病機制：IDD發生與腰椎間盤神經分布相關密切。腰椎間盤在纖維環外1/3處存在豐富的神經分布，正常情況下纖維環內1/3和髓核無神經分布。纖維環前外側由灰交通支支配，后外側主要由竇椎神經分布。石作為等研究認為部分椎間盤源性腰痛也具有牽涉痛的性質［3］，其理由為腰椎間盤后部纖維環及后縱韌帶受脊神經和交感神經的雙重支配，交感神經可傳遞疼痛，脊神經節多極神經元的存在且能夠傳遞疼痛。

椎間盤內化學物質的刺激：炎癥介質也與椎間盤源性疼痛的發病機制有關。研究發現退變的人椎間盤組織可自動分泌大量的促炎癥反應介質，使局部出現自身免疫炎癥反應。

椎間盤內機械壓力的改變：正常椎間盤在生理負重下不會刺激外部纖維環上的傷害感受神經末梢。隨著椎間盤的退化，髓核和軟骨終板變性，纖維環的松弛或破裂可導致椎體間不穩，造成椎間盤內壓力的分布不均衡，并導致椎間盤出現異常活動，這些異常活動對纖維環的后1/3和相鄰的后縱韌帶中帶有大量來自竇椎神經的感覺神經末梢產生機械刺激而引起疼痛。

硬膜外炎癥及化學性神經根炎：由纖維環破裂導致的硬膜外炎癥也可能導致疼痛的產生，Saifuddin等研究伴隨纖維環破裂的硬膜外炎癥患者［4］，在8例患者MRI的T2加權像發現12個破裂的纖維環，而炎性改變總伴隨有纖維環的破裂。其中4例患者炎性區域直接包括神經根。這些結果表明，由纖維環破裂處的炎性化學性神經根病可能是纖維環撕裂引起疼痛的重要原因。

椎間盤源性腰痛的診斷研究

椎間盤源性腰痛臨床表現常為L4/L5/S1棘間、髂后、臀部、腹股溝、股前、股后、大轉子等處的自發脹痛。患者常常需要手扶大腿才能坐在椅子上或從椅子上站起。雖然椎間盤源性腰痛可以伴有腿痛，但是，腿痛通常沒有明確的概念，常常難以言表，多主訴為臀部或下肢沉重感或抽筋，而且疼痛區域缺乏沿神經分布的特點，神經系統檢查正常，沒有皮膚過敏或感覺缺失。

在影像學診斷方面，普通X線攝片和CT表現基本正常。MRI對于椎間盤源性疼痛的診斷有重要的意義。椎間盤造影術是椎間盤源性疼痛最重要的診斷方法，在診斷椎間盤源性腰痛上，椎間盤造影必須包括4個要素：椎間盤形態，椎間盤內壓力或可注射的液體量，注射時誘發出主觀感覺的疼痛，相鄰節段注射時沒有主觀疼痛反應，這四個要素缺一不可。椎間盤造影能夠準確地復制出平時的疼痛甚至被認為是診斷椎間盤源性腰痛的金標準。

椎間盤源性腰痛治療進展

非手術治療：由于IDD最終確認診斷需經椎間盤造影有創檢查，所以當初步印象為IDD時，一般先采用3個月左右的保守治療，保守治療包括臥床休息、腰背肌鍛煉、口服止痛藥、牽引、理療、推拿按摩、針灸、針刀、封閉等。迄今為止尚無高質量的研究證明某項保守治療方法與其他或手術治療相比具有優越性。

手術治療：當保守治療無效時，椎間盤造影即為必要的檢查。對于手術治療時機及指征，Linson提出癥狀至少持續l2個月［5］，椎間盤造影疼痛誘發試驗陽性，在CTD顯示異常形態學改變，此為介入治療和手術治療的指征。

微創治療：經皮技術治療IDD的方法主要有：經皮穿刺腰椎間盤摘除術、椎間盤內藥物注射(如亞甲基藍椎問盤內注射)、經皮穿刺髓核化學溶解術、經皮穿刺腰椎間盤內臭氧注射術、經皮穿刺腰椎間盤激光消融術(PLDD)、椎間盤內電熱療法(IDET)、椎間盤等離子消融術、射頻消融和側后路內鏡輔助技術等。

開放手術治療椎間盤源性腰痛的手術治療方法：⑴椎間融合術：椎間融合術包括前路椎間融合術(ALIF)、后路椎間融合術(PLIF)、經椎間孔椎間融合術(TLIF)融合等。由于椎間融合器械的使用和推廣，椎間Cage融合器和椎弓根釘桿系統逐漸取代了單純植骨融合技術和單純釘板系統，椎間融合率大幅度提高。目前，椎間融合術已成為治療椎間盤源性下腰痛的金標準，但高融合率并不一定代表治療的高成功率。臨床長期隨訪結果顯示，在融合良好的病例中仍有相當比例的患者癥狀并未改善，而且椎間融合術中晚期并發的鄰近節段病也是脊柱外科醫生必須面對的難題之一。⑵非融合一動態穩定手術：①棘突間固定：一般認為，纖維環后部是椎間盤源性腰痛主要的疼痛來源，棘突間固定可通過撐開脊柱后方結構來減少纖維環后部的壓力負荷，恢復椎間隙的高度，可以減少對竇椎神經傷害性神經末稍的機械刺激而緩解疼痛，還可以促進纖維環等機構的恢復。②人工髓核置換術：目前在髓核假體中研究最多、使用最廣泛的是PDN假體，該手術保留了纖維環、終板及韌帶等結構，手術創傷小，但髓核假體要求椎間盤纖維環完整，否則容易造成假體脫出，在很大程度上限制了該手術的應用范圍。③人工椎間盤置換術(TDR)人工椎間盤置換術的優點在于：徹底切除病變椎間盤，消除椎間盤源性疼痛；恢復椎間高度，神經根能充分活動；恢復生理前凸，獲得生物力學平衡；恢復運動功能，防止相鄰節段退變。

討 論

椎間盤源性腰痛是慢性退行性疾病，對于其病因、發病機制、診斷及治療已進行了大量的研究，但該疾病與基因的關系還不明確，還沒有一種比椎間盤造影更加可靠和特異性的診斷方法。目前沒有一種治療方法對所有的椎間盤源性腰痛都有效，而大多數患者通過保守治療都能夠緩解，這些方法費用低，操作簡單，無侵入性，因此保守治療應該成為椎間盤源性腰痛治療策略的第一階梯［6］。微創治療具有創傷小，安全可靠，治療效果并不比手術等其他治療方法差，對保守治療無效的患者，可以考慮IDET、RFA、PLDD等微創手術治療，盡可能推遲開放性手術的時間。隨著非融合手術的研究不斷深入，棘突間固定，人工髓核及人工椎間盤置換術，取得了較好的短期療效，目前還缺乏長期隨訪和大樣本的研究，但這可以推遲行椎體間融合手術的時間。近年來，人們發展了異體椎間盤移植和基因修飾治療椎間盤退變等新方法，前者由于存在早期退變等一系列問題而難以再臨床應用；基因治療椎間盤退變尚處于早期的實驗階段，但可以肯定，基因和細胞水平治療椎間盤源性下腰痛將是以后臨床和基礎研究的重點方向之一。

參考文獻

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3 石作為,姚猛,王巖松,等.間盤源性下腰痛發生機制的探討.中國疼痛醫學雜志,2007,3:32-35.

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第9篇

    1癌癥心理護理

    大量事實證明,癌癥患者生命期不僅取決于病情和醫療措施,而且與患者自身的精神狀態密切相關。調查結果表明:癌癥患者確診后產生否認、多疑、緊張、悲觀、恐懼、絕望等負性情緒,對機體免疫功能有明顯的抑制作用,嚴重影響生存率和生活質量。所以心理護理對癌癥患者非常重要,也是整體護理的核心內容,心理護理質量的高低決定著護理質量的高低。和藹的態度、精湛的技術、強烈的責任心是心理護理的基礎。護士要盡可能和患者建立起良好的護患關系,為患者創造溫馨舒適的生活環境,解開患者的心結,激發患者生存欲望,使他們走出心理陰霾,樹立和醫護人員緊密配合的心理認同感。由于患者的思維層次、溝通意愿和對腫瘤認識存在的差異,實現與他們的心靈溝通,護士要有高度的同情心,理解患者的心理活動規律,運用一定的技巧,根據患者情況采用相應的方法。有移情法、暗示法、開導法、集體心理治療等。要因人而異,有的放矢。

    2癌癥飲食護理

    由于癌癥導致患者代謝紊亂、負氮平衡,免疫力低下,白細胞減少,脫發等,最終成為惡病質。因此對患者進行飲食護理,改善營養狀況十分必要。護士要采取各種方法鼓勵患者進食,經常更換食譜,變化烹調方式,注意色、香、味的調配,給予高熱量、高蛋白,少油膩、易消化的清淡飲食,少食多餐。每天攝入新鮮蔬菜水果,以提高食欲,補充微量營養素,對進行放、化療的患者,要常吃動物肝臟、豬血、瘦肉、黑芝麻,蓮子、大棗、枸杞子、桂圓等,以維持正常的血細胞數量和功能;建議多進食含鉀高的水果,如苷橘、香蕉等,同時忌煙酒、濃茶、咖啡及粗糙的食物;如果出現咽喉有灼熱感,口干,吞咽困難等口腔粘膜反應,應給患者經常漱口,保持口腔濕潤,食物制成肉汁、肉湯一起進食,有助于吞咽,從而提高患者的進食量。盡力創造干凈、舒適、清潔的病房進食環境。

    3癌癥姑息護理

    姑息護理是新興的學科,是對根治性治療無反應的患者積極的整體關懷護理,即通過早期識別、積極評估、控制疼痛和治療其他痛苦癥狀,擺脫軀體、心理、社會和宗教的困擾,從而改變患者及親人的生活質量。姑息護理強調四全服務,即全人、全家、全程、全隊。通過團隊的方法提供整體護理,把患者、家屬作為照護單元。不主張實施可能給患者增添痛苦和無意義的治療或過度治療,強調減輕痛苦,讓患者平靜、安然、有尊嚴地離開人世,即優化生命末端質量。

    姑息護理的基本內容有:①控制癥狀,特別是控制疼痛,包括PCA技術,WHO推薦癌癥鎮痛三階梯止痛法,藥物阻滯,放射治療,基因治療等。②支持患者,讓患者參與決策,尊重其自主權。告知病情及進程,與患者商量護理計劃,及時反饋治療效果,提供必要的信息來源和社會支持。③支持家屬,姑息護理視患者和家屬為整體。患者親屬存在遷就、絕望、厭煩、疑慮、恐懼死亡的心理,護士應同情和理解他們,耐心傾聽他們意見和要求,并指導他們承認現實,從容應對,在患者面前保持良好心態。④死亡教育:要讓患者清楚,死亡是人生發展的必然結果,從某種意義上講,死亡是痛苦的自然解脫方式。面對死亡,不要惋惜,要順其自然,更無須后顧之憂,親人自會平安生活,未盡事業后繼有人,讓患者達到“生如春之燦爛,死如秋之靜美”的境界.4癌癥音樂護理音樂作為一種非語言性溝通手段,常常在進入人的深層意識時,能優于單純于運用語言治療的方法,起到普通心理療法達不到的效果。不同樂曲作用于人的感覺器官,產生鎮靜情緒、改善睡眠、增進食欲、緩解疼痛等不同作用。

    音樂護理的方法:①音樂演奏法:由患者自己演奏音樂,以達到充分散發壓力和感情的目的。也可以組合演奏。②音樂欣賞法:護士根據情況安排一定的時間聽音樂或播放歌曲。患者通過聽覺、視覺等欣賞音樂,用音樂本身具有的內在涵義及魅力幫助患者康復。

    音樂對癌癥患者生活質量有較好的干預作用。李桂蘭等報道:音樂療法有助于癌癥患者情緒穩定,減輕其在化療過程中產生的焦慮、恐懼等不良心理反應,提高機體的自我調節能力。萬永慧等?認為:音樂療法可減少癌癥患者的狀態焦慮和特質焦慮,是一種受患者歡迎的輔助治療方法。王保勝等研究結果表明:音樂療法可較快改善癌癥患者的焦慮、抑郁的心理狀態,對患者有鎮靜、鎮痛作用,并能減輕因放療引起的惡心、乏力等癥狀。

    5癌癥疼痛護理

    據報道每天有350萬以上的癌癥患者有疼痛癥狀,晚期癌癥患者70%左右以疼痛為主訴,其中5O%屬于劇烈疼痛,對患者生存產生極大負面影響。近年來,國內外控制疼痛的方法不斷發展及完善。

    大家普遍認為,護士首先要掌握癌性疼痛的分級標準,英國的Weng—Baker面部表情量表,采用六種面部表情,從微笑到悲傷甚至哭泣來表達疼痛的程度,各年齡組從三歲至很虛弱的老人,該方法經大量使用后,都肯定了其實用性和合理性疼痛護理方法包括:①建立家庭式病室,給患者創造一個良好的環境,病室的布置要安靜整潔,優美溫馨。②建立良好的護患關系,護士要做到語言文明,舉止端莊,操作熟練,以取得患者的信任,使患者敢于面對現實,積極配合治療,頑強地與疼痛作斗爭。③藥物止痛,在止痛藥的應用上要有長期安排,打破按需給藥的舊觀念,采用分階段復合給藥方式,使疼痛在尚未開始或剛開始便得到控制,保證藥物在體內維持一定濃度,這樣不僅能避免劑量的逐漸增大醫學教育|網搜集整理,還可減少患者對疼痛的恐懼感。④其他方法:包括患者的自我控制止痛法(PCA)、藥物阻滯,破壞神經痛覺通路法及神經外科手術方法等。

    護士要掌握患者疼痛的信息,正確評估疼痛的程度,根據患者不同情況,做出及時有效的處理。

    6癌癥社會支持護理